Estudio de la participación de la bradiquinina en el desarrollo postnatal de la papila renal

Fil: Guaytima, Edith del Valle. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLa organogénesis del riñón es un proceso secuencial cuyo principal evento es la mutua inducción entre las células del mesénquima metanéfrico (MM), y las células epiteliales del brote ureteral (BU). Como resultado, el MM experimenta una transición mesénquima?epitelio (TME) para dar origen al nefrón, y el BU sufre sucesivas ramificaciones que originarán el sistema de túbulos colectores. Durante la nefrogénesis, la síntesis de bradiquinina (BK) aparece muy temprano, y la expresión del ARNm para su receptor B2 (RB2) es mucho mayor en el riñón en desarrollo que en el adulto. Asimismo, el bloqueo farmacológico del RB2 durante la etapa fetal provoca una diferenciación anormal de los túbulos renales, pero aún no se han descripto las causas bioquímicas ni morfológicas que lo justifiquen. Por lo tanto, se planteó como objetivo general estudiar el papel que cumple la hormona intrarrenal BK en el desarrollo posnatal de la papila renal. Se eligió como modelo de estudio cultivos primarios de células de TCd de papila renal de ratas neonatas, puesto que en la rata, el riñón completa su desarrollo en el periodo posnatal.\nLa primera parte de esta tesis se centró en la caracterización morfológica y fenotípica de las células de TCd en el cultivo primario. Mediante ensayos de inmunofluorescencia de doble marcación se observó que las células de TCd en cultivo poseen una gran tendencia a unirse entre sí para formar colonias migratorias, que se evidenció por la presencia de lamelipodios en las células del borde de la colonia. Durante el desarrollo renal, los cambios morfológicos ocurren aceleradamente. En los cultivos primarios, estos cambios se ven reflejados en el alto nivel de heterogeneidad que exhiben las colonias, en relación con el grado de asociación, y de maduración o diferenciación de las células de TCd.\nPor otra parte, el análisis fenotípico de las células que aparecen en los cultivos primarios como células aisladas, brindó la información necesaria para concluir que se trata de células mesenquimáticas. Las reconstrucciones 3D y perfiles xz permitieron deducir que estas células se localizan de forma adyacente o por debajo de las células de la monocapa. La baja velocidad y cortos tiempos de centrifugación aplicados durante el aislamiento de los TCd de la papila, evitó la contaminación con células individuales. Por lo tanto, se interpreta que estas células con características mesenquimáticas se originan in situ en el cultivo primario mediante un proceso de transición epitelio-mesénquima (TEM) de las células de TCd. El conjunto, los resultados sugieren la existencia de un ?equilibrio dinámico? entre las células de TCd que forman parte de las colonias, y las células que no lo hacen, fuertemente desplazado hacia las primeras. Las reconstrucciones 3D, perfiles xz y experimentos en tiempo real muestran claramente que las células mesenquimáticas generadas in situ, finalmente se insertan entre las células de la colonia, y, como consecuencia de la inducción por parte de las células de TCd, experimentan una TME para quedar definitivamente integradas en la monocapa. Sobre la base de los resultados expuestos, se plantea un modelo en el cual las células mesenquimáticas que se originan de novo funcionarían de nexo entre el modelo de nefrogénesis propuesto más recientemente que incluye dos conversiones fenotípicas (TEM-delaminación-TME), y el modelo clásico de mutua inducción.\nEn la segunda parte de la tesis se estudió el efecto de la BK sobre las células de TCd. Para ello, las células se estimularon con BK en presencia o en ausencia de un antagonista específico de RB2, HOE-140, o de un inhibidor específico de PI3K, LY294002. El análisis de las células de TCd tratadas con BK reveló la formación de un córtex continuo de filamentos de actina alrededor de la colonia, y la presencia de bordes ondulatorios o ?ruffles? de membrana en las células de la periferia. Los experimentos realizados en tiempo real confirmaron tales fenómenos y mostraron un aumento en la velocidad de formación y tamaño de lamelipodios y ?ruffles?, así como la adquisición de un mayor nivel de compactación celular, reflejado por la disminución del área total de las colonias. El pre-tratamiento con HOE-140 afectó la adhesión célula-célula inducida por BK y la formación de ?ruffles?. El análisis conjunto de las imágenes de inmunofluorescencia y los resultados de experimentos realizados en tiempo real en presencia de LY294002, demostraron la participación de PI3K en la asociación célula-célula, y en la formación de estructuras migratorias inducidas por BK. Asimismo, el análisis por Western blot evidenció que la activación de PI3K mediada por la unión de BK a RB2 induce en la células de TCd la activación de su efector ?corriente abajo? Akt, debido a un incremento de su forma fosforilada (Akt-P), hecho que ocurre solo en ausencia de HOE-140, y de LY294002. Esta situación se vio reflejada en las imágenes de inmunofluorescencia, donde se observa una mayor intensidad de marcación de Akt-P, y también de Rac1, un conocido efector ?corriente abajo? de PI3K que participa en la formación de lamelipodios.\nResumen\n3\nEn conclusión, los resultados presentados en este trabajo de tesis doctoral ofrecen nuevas evidencias experimentales que resaltan el rol que ejerce la BK durante el desarrollo postnatal del riñón, a través de su unión a RB2 y posterior activación de la vía PI3K/Akt/Rac1, mecanismo que favorece la migración colectiva del BU durante la nefrogénesis, desde la zona donde se origina en la papila, hasta la corteza renal donde ocurre la mutua inducción entre el MM y el BU, para dar origen al nefrón y al sistema de túbulos colectores, respectivamente