Estudios sobre sulfatación en Trypanosoma cruzi y participación de los motivos sulfatados en la infección e inmunomodulación del hospedador

Fil: Ferrero, Maximiliano Rubén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto Nacional de Parasitología Dr. Mario Fatala Chaben; ArgentinaTrypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas, es un protozoario hemoflagelado que posee una cisteína proteinasa mayoritaria denominada cruzipaina (Cz). Esta enzima además de un dominio catalítico, presenta un dominio C-terminal (C-T) de relevancia inmunológica. Nuestro grupo ha descripto previamente en este dominio, una O-glicosilación constituida por N-acetil glucosamina y una N-glicosilación compuesta por oligosacáridos de alta manosa, y un grupo sulfato constituyendo el primer reporte de glicoproteínas sulfatadas en Trypanosomátidos. Además, encontramos que los sulfatos presentes en la Cz presentan una marcada antigenicidad en pacientes con enfermedad de Chagas y también en modelos de infección murino donde además estarían directamente relacionados con el daño del tejido cardíaco. A pesar de la relevancia que muestran los motivos sulfatados del parásito nada se sabe del mecanismo de sulfatación ni acerca de su rol en el metabolismo del mismo.\nLa sulfatación, modificación crítica en muchas instancias de reconocimiento biológico, es catalizada por enzimas denominadas sulfotransferasas las cuales dependen para llevar a cabo su función de una molécula denominada PAPS (3'- fosfoadenosina-5' fosfosulfato). En este trabajo, estudiamos el efecto del clorato de sodio, un reconocido inhibidor de la síntesis de PAPS. En epimastigotes tratados con dicho inhibidor, observamos tanto una disminución de la sulfatación de la Cz por western blot como un desplazamiento hacia puntos isoeléctricos más altos en electroforesis bi-dimensional. Además vimos un marcado descenso de sulfoglicoesfingolípidos en cromatografía de placa delgada, confirmado mediante el análisis por espectrometría de masa (UV-MALDI-TOF). Estos parásitos mostraron anormalidades estructurales en imágenes de microscopía electrónica, y cuando se utilizó el tratamiento sobre trypomastigotes, obtuvimos una disminución marcada en la capacidad infectiva de los mismos. Mediante ensayos de citometría de flujo vimos una fuerte presencia de los epitopes sulfatados de la Cz expuestos en la superficie de trypomastigotes y en ensayos de infección posteriores pudimos demostrar la participación de estos epitopes presentes en el dominio C-T de la Cz en dicho proceso.\nLas siglecs (sialic acid recognizing Ig-superfamily lectins), son un grupo de lectinas de reconocimiento a ácido siálico, expresadas en células del sistema inmune e involucradas en la regulación negativa de la activación de las mismas. Se ha demostrado que la señalización por vía de las Siglecs muchas veces depende del contexto glicosídico en el cual se encuentre el ácido siálico y que T. cruzi es reconocido por estas lectinas.\nNuestros resultados con Siglec-E de ratón, ortóloga de la Siglec-9 humana, mostraron que los ligandos de esta lectina en el parásito están específicamente expuestos en proteínas de membrana. Además, existe un reconocimiento de esta lectina a Cz tanto lisosomal de epimastigotes como de Cz liberada al medio por trypomastigotes metacíclicos. La participación de los sulfatos de la Cz promoviendo esta interacción fue demostrada en ensayos de ELISA directo en los cuales Cz y C-T tuvieron un reconocimiento significativamente mayor al de Czd y C-Td. Estos resultados fueron confirmados en ensayos de ELISA de competencia entre Cz y Czd. Por último mediante tratamientos con clorato de sodio, demostramos que la presencia de sulfatos en la superficie del parásito incrementa el reconocimiento de Siglec-E por los mismos utilizando citometría de flujo. En conjunto nuestros resultados sugieren que las glicoproteínas silalidadas del parásito, que contienen grupos sulfatos como la Cz, interaccionan con Siglec-E modulando la respuesta inmune del hospedador, favoreciendo la parasitemia y la persistencia del parásito.\nFinalmente considerando los antecedentes detallados sobre la relevancia de la sulfatación tanto en el metabolismo del parásito como en el desarrollo de la enfermedad de Chagas; sumado a la ausencia de secuencias genómicas que podamos identificar como posibles sulfotransferasas del parásito, sostenemos firmemente que esta vía es un blanco potencial terapéutico de relevancia.\