Efeitos do extrato de mirtilo em modelo de hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina

Introdução: A hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma doença caracterizada por disfunção endotelial progressiva e remodelamento vascular, levando ao aumento da resistência vascular pulmonar e à insuficiência do ventrículo direito (VD). Diversos elementos contribuem para a sua fisiopatologia, como o desequilíbrio entre vasodilatadores e vasoconstritores, maior ativação simpática e, como um dos elementos centrais, o estabelecimento do quadro de estresse oxidativo. Nesse contexto, o uso de antioxidantes naturais pode auxiliar a restaurar a homeostase redox e proteger os tecidos diretamente afetados na patologia, pulmões e VD. Assim, o mirtilo (blueberry - BB), um dos alimentos com maior capacidade antioxidante e tendo apresentado benefícios em outras condições patológicas, surge como uma alternativa de intervenção na HAP. Objetivos: Esse trabalho teve como finalidade avaliar os efeitos do extrato de mirtilo sobre os pulmões e VD em um modelo in vivo de HAP induzida por monocrotalina, verificando sua atuação sobre parâmetros morfo-funcionais, bem como sua modulação do estado redox. Além disso, para avaliar o papel do extrato sobre possíveis vias envolvidas nas alterações do equilíbrio redox e na morte/sobrevivência de cardiomiócitos do VD, o desenvolvimento de um modelo in vitro de lesão de cardiomiócitos induzida por noradrenalina também foi alvo desse estudo. Material e Métodos: Ratos Wistar machos (200 ± 20 gramas, n = 72) foram divididos em oito grupos: Grupo Controle (CTR); Grupo Controle BB 50 mg/kg/dia (CTR BB50); Grupo Controle BB 100 mg/kg/dia (CTR BB100); Grupo Controle BB 200 mg/kg/dia (CTR BB200); Grupo Monocrotalina (MCT); Grupo Monocrotalina BB 50 mg/kg/dia (MCT BB50); Grupo Monocrotalina BB 100 mg/kg/dia (MCT BB100) e Grupo Monocrotalina BB 200 mg/kg/dia (MCT BB200). A HAP foi induzida por dose única de monocrotalina (60 mg / kg, intraperitoneal). Os animais receberam extrato de mirtilo oralmente, por gavagem, nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg/dia. O tratamento com extrato de mirtilo durou 5 semanas (2 semanas anterior à indução por MCT e 3 semanas pós-indução). Ao 35º dia do protocolo experimental, os animais foram submetidos às análises morfométricas, ecocardiográficas e hemodinâmicas. Em seguida, os animais sofreram eutanásia, com coleta dos pulmões e coração para posteriores avaliações bioquímicas do equilíbrio redox. Cardiomiócitos (células H9c2) foram cultivados em quatro condições: meio de cultura com ausência de noradrenalina (NE) e extrato de mirtilo (BBE): grupo Controle; meio na presença de 50 μg/ml de extrato de mirtilo: grupo BBE; meio na presença de 100 μM de noradrenalina: grupo NE; e meio na presença de 50 μg/ml de extrato de mirtilo e 100 μM de noradrenalina: grupo BBE+NE. Foram avaliadas a viabilidade celular, a ativação de caspases, o nível de estresse oxidativo e a expressão proteica de enzimas antioxidantes e proteínas sinalizadoras de vias redox e de morte/sobrevivência. Resultados: O tratamento com extrato de mirtilo levou à melhora de parâmetros funcionais afetados pela HAP: aumentou a razão E/A pelo fluxo da tricúspide, a razão AT/ET pelo fluxo da artéria pulmonar, o TAPSE e o débito cardíaco do VD, ao passo que reduziu os diâmetros finais diastólico e sistólico do VD. A intervenção com o extrato também promoveu melhoras hemodinâmicas, evidenciadas pela atenuação dos valores das pressões sistólica do VD e média da artéria pulmonar, bem como reduziu a derivada pressão/tempo de contratilidade do VD. Essas alterações benéficas do extrato parecem ter sido consequência da retomada do equilíbrio redox. No tecido pulmonar, o tratamento diminuiu a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), reduziu a atividade de NADPH oxidases e a expressão da enzima xantina oxidase, reduziu o dano oxidativo a lipídios, levou ao aumento da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx) e elevou o conteúdo de sulfidrilas. Além disso, o extrato retomou a expressão do fator 2 relacionado ao fator nuclear eritróide 2 (Nrf2) e diminuiu a razão da expressão proteica dos receptores de endotelina ETA/ETB. A intervenção com o mirtilo diminui a hipertrofia do VD, avaliada pelos índices de massa do VD/massa corporal, massa do VD/massa do ventrículo esquerdo e massa do VD/comprimento da tíbia. De forma semelhante à descrita para o tecido pulmonar, o extrato de mirtilo gerou retomada do equilíbrio redox no VD, ao ocasionar diminuição da atividade de NADPH oxidases, redução da lipoperoxidação e estimular maior atividade da enzima catalase. Os efeitos do extrato de mirtilo, quando avaliados sobre cardiomiócitos cultivados na presença de noradrenalina, incluem aumento da viabilidade celular e diminuição da atividade e expressão de caspases. Esses resultados foram associados à prevenção do quadro de estresse oxidativo induzido por noradrenalina, uma vez que verificamos diminuição da produção de EROs, da expressão da isoforma Nox2 das NADPH oxidases e do marcador de oxidação de ácidos graxos 4-hidroxinonenal (4-HNE). Também observamos aumento das expressões das enzimas SOD, GPx e catalase quando do tratamento com o extrato. Em relação às vias de sinalização, a noradrenalina levou ao aumento da expressão da proteína quinase B (Akt), Forkhead box O3a (FoxO3a) e da proteína quinase alfa ativada por AMP (AMPKα), bem como à diminuição da expressão proteica do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3). O extrato atenuou o aumento da expressão de Akt, aumentou ainda mais a expressão FoxO3a e restaurou a expressão de STAT3. Além disso, extrato aumentou a expressão das proteínas mTOR e p70S6. Conclusão: O presente estudo demonstrou que o tratamento com o extrato de mirtilo na HAP promove benefícios morfométricos, funcionais e hemodinâmicos cardiopulmonares. Particularmente, esses efeitos estão relacionados com a melhora do estado redox no tecido pulmonar e VD. O extrato de mirtilo ocasiona alterações positivas no equilíbrio redox através de sua atuação sobre diferentes vias de sinalização, que envolvem também a regulação de mecanismos de morte e sobrevivência celular de cardiomiócitos. Assim, o extrato de mirtilo surge como uma possível intervenção dietoterápica no tratamento da HAP.Introduction: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease characterized by progressive endothelial dysfunction and vascular remodeling, leading to increased pulmonary vascular resistance and right ventricular (RV) insufficiency. Several elements contribute to its pathophysiology, such as the imbalance between vasodilators and vasoconstrictors, higher sympathetic activation and, as one of its central elements, the establishment of oxidative stress. In this context, the use of natural antioxidants can help restore redox homeostasis and protect the tissues directly affected by the pathology, lungs and RV. Thus, blueberry (BB), one of the foods with higher antioxidant capacity and having shown benefits in other pathological conditions, appears as an alternative intervention in PAH. Objectives: The aim of this study was to evaluate the role of blueberry extract on the lungs and RV in an in vivo model of monocrotaline-induced PAH, verifying its effects on morphofunctional parameters, as well as its modulation of the redox state. Furthermore, we aimed to evaluate the role of the extract on possible pathways involved in redox balance changes and cardiomyocytes death/survival in the RV. For that, the development of an in vitro model of norepinephrine-induced cardiomyocyte injury was also subject of this study. Material and Methods: Male Wistar rats (200 ± 20 grams, n = 72) were divided into eight groups: Control Group (CTR); Control Group BB 50 mg/kg/day (CTR BB50); Control Group BB 100 mg/kg/day (CTR BB100); Control Group BB 200 mg/kg/day (CTR BB200); Monocrotaline Group (MCT); Monocrotaline BB Group 50 mg/kg/day (MCT BB50); Monocrotaline BB Group 100 mg/kg/day (MCT BB100) and Monocrotaline BB Group 200 mg/kg/day (MCT BB200). PAH was induced by a single dose of monocrotaline (60 mg/kg, intraperitoneal). The animals received blueberry extract orally by gavage at the doses of 50, 100 and 200 mg/kg/day. Blueberry treatment lasted 5 weeks (2 weeks prior to MCT induction and 3 weeks post-induction). On the 35th day of the experimental protocol, the animals were submitted to morphometric, echocardiographic and hemodynamic analyses. Then, the animals were euthanized, with lung and heart harvesting for further biochemical redox balance assessments. Cardiomyocytes (H9c2 cells) were incubated under four conditions: culture medium in the absence of norepinephrine (NE) and blueberry extract (BBE): Control group; culture medium in the presence of 50 μg/ml blueberry extract: BBE group; culture medium in the presence of 100 μM noradrenaline: NE group; and culture medium in the presence of 50 μg/ml blueberry extract and 100 μM norepinephrine: BBE + NE group. Cell viability, caspases activation, oxidative stress level and protein expression of antioxidant enzymes and redox and death/survival signaling proteins were evaluated. Results: Treatment with blueberry extract improved functional parameters affected by PAH: increased E/A ratio for tricuspid flow, AT/ET ratio for pulmonary artery flow, RV TAPSE, and RV cardiac output, while reduced the final diastolic and systolic diameters of the RV. Intervention with the extract also promoted hemodynamic improvements, evidenced by the attenuation of the RV systolic pressure and mean pulmonary artery pressure, as well as reduced the RV positive pressure/time derivative. These beneficial alterations of the extract seem to have been a consequence of the redox balance recovery. In lung tissue, treatment decreased the production of reactive oxygen species (ROS), reduced NADPH oxidase activity and xanthine oxidase expression, reduced oxidative damage to lipids, led to increased superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx) activities and increased sulfhydryl content. In addition, the extract increased nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) expression and decreased the protein expression ratio of ETA/ETB endothelin receptors. Blueberry intervention decreased RV hypertrophy, as assessed by RV mass/body mass, RV mass/left ventricle mass and RV mass / tibial length indices. Like that described for lung tissue, blueberry extract induced redox balance recovery in the RV, causing decreased NADPH oxidase activity, reduced lipoperoxidation and stimulated catalase enzyme activity. The effects of blueberry extract when evaluated on cardiomyocytes cultured in the presence of norepinephrine include increased cell viability and decreased activity and expression of caspases. These results were associated with the prevention of norepinephrine-induced oxidative stress, since we observed a decrease in ROS production, NADPH oxidase isoform Nox2 expression and 4-hydroxynonenal fatty acid oxidation marker. We also observed increased expression of SOD, GPx and catalase enzymes when cells were treated with the extract. Regarding signaling pathways, norepinephrine led to increased expression of Protein kinase B (Akt), Forkhead box O3a (FoxO3a) and AMP-activated protein kinase alpha (AMPKα), as well as decreased protein expression of the Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). The extract attenuated the increase in Akt expression, further increased FoxO3a expression and restored STAT3 expression. In addition, blueberry extract increased expression of Mammalian target of rapamycin (mTOR) and p70S6 proteins. Conclusion: The present study demonstrated that treatment with blueberry extract in PAH promotes cardiopulmonary morphometric, functional and hemodynamic benefits. Particularly, these effects are related to the improvement of redox state in lung tissue and RV. Blueberry extract causes positive changes in redox balance through its action on different signaling pathways, which also involve the regulation of cell death and survival mechanisms of cardiomyocytes. Thus, blueberry extract appears as a possible dietary intervention in the treatment of PAH