Clonning and heterologous expression of structural proteína (C, prM, E) of Zika Virus (ZIKV)

Viruses are organisms which depend on the host cellular machinery to replicate, and are relevant to human, livestock and plant health. The modern threat of emerging pandemics is pressing and, in this scenario, Zika Virus (ZIKV) is an important recent example, due to recent epidemics and confirmation of its involvement in congenital development and neurological manifestations. The ability to produce recombinant virus like particles (VLPs) and recombinant proteins can lead to the understanding of its structure and the development of new therapeutic approaches, as well as the understanding of interaction mechanisms between the virion and host cell. This study aims to achieve heterologous production of ZIKV VLPs as well as ZIKV Capsid protein for future structural analysis and to make them available to the research community. A recombinant construct containing the three structural proteins of ZIKV (C, prM and E) cloned into pPICZα vector was integrated in Pichia pastoris genome for AOX1 promoter induced expression. C protein coding region was cloned into Escherichia coli expression vector for separate expression and purification by affinity chromatography using a 6xHis tag construct. Integration of the coding region for the proteins C, prM and E in the P. pastoris genome was confirmed via PCR and sequencing. Results showed the possibility of obtaining soluble secreted recombinant product. Production of isolated C protein was achieved in E. coli and its purification was performed through affinity chromatography.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Vírus são organismos que dependem da maquinaria celular de hospedeiro para sua replicação, e são relevantes para a saúde humana, de animais e plantas. A ameaça moderna de pandemias emergentes é urgente e, nesse cenário, o Zika virus (ZIKV) é um novo exemplo importante, devido a epidemias recentes e a confirmação de seu envolvimento no desenvolvimento congênito e manifestações neurológicas. A capacidade de produzir partículas tipo vírus (VLP, do inglês virus­like particles) e proteínas virais recombinantes pode levar ao melhor entendimento de sua estrutura e ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, assim como o entendimento de mecanismos de interação entre vírion e célula hospedeira. Esse estudo tem como objetivo obter a expressão heteróloga de VLPs de ZIKV, assim como proteína do Capsídeo (C) de ZIKV para futuras análises estruturais e para viabilizá­las para a comunidade científica. Uma construção recombinante contendo as três proteínas estruturais de ZIKV (C, prM e E) clonada em vetor pPICZα foi integrada ao genoma de Pichia pastoris para a expressão induzida sob o promotor AOX1. A região codificante da proteína C foi clonada em vetor de expressão de Escherichia coli para expressão da proteína isolada e purificação por cromatografia de afinidade utilizando uma sequência de histidinas (6xHis). A integração da região codificante das proteínas C, prM e E foi confirmada por PCR e sequenciamento de nucleotídeos. Resultados mostraram a possibilidade da obtenção de proteínas recombinantes solúveis. A produção da proteína C isolada em E. coli foi confirmada e sua purificação realizada através de cromatografia de afinidade. Estes resultados abrem caminho para a produção recombinante de ZIKV que poderão contribuir para o futuro desenvolvimento de terapias eficazes contra a infecção.CNPq: 132604/2016-