Study of alternative pathways to the LiaFSR and YycFGHIJ systems that lead to the decrease of Daptomycin susceptibility in Enterococcus faecium

Enterococcus is one of the most important multi-drug resistant nosocomial pathogens. Infections caused by vancomycin resistant Enterococci (VRE) are becoming increasingly difficult to treat, often with prolonged hospital outbreaks that are real challenges. Daptomycin (DAP) is a drug of last resort for treating infections caused by VRE; mainly E. faecium belonged to clonal complex 17, called "high risk" clone. In this study, samples of E. faecium from the Hospital de Base de São Jose do Rio Preto were analyzed by molecular typing and the susceptibility profile to several antimicrobials was determined. A high-risk vancomycin-resistant clone with reduced susceptibility to daptomycin has been identified spreading in the hospital. The mechanism of DAP resistance is not fully elucidated. For the purpose of studying the mechanism of resistance to DAP in the clinical isolates of this hospital and to identify new pathways to resistance, DAP hyper-susceptible E. faecium HBSJRP18 clinical isolate was used to perform in vitro selections until resistant mutants were obtained. Subsequently, genes with mutation in these selected isolates, as well as those already described in the literature, were analyzed in the clinical samples. Genomes of these mutants were sequenced and compared to the DAP hyper-susceptible E. faecium HBSJRP18 to detect the presence of single nucleotide polymorphism (SNP) in genes that may be related to resistance to DAP. The mutated/intact genes were overexpressed in the hyper-susceptible/resistant strain, thus DAP MIC was determined to investigate their roles in resistance to that antibiotic. The genes that showed mutations in the three BHI selections were lafB-like, a glycosyltransferase possibly involved in the LTA biosynthesis, and dhaK, a dihydroxyacetone kinase possibly involved in the metabolism of glycerol. Cloning and overexpression of the genes of interest were performed, which enabled the evidence of the role of lafB-like in hyper-susceptibility to DAP. dhaK still remains unclear if it is actually involved in resistance. Mutations in these genes were also found in all clinical samples, as well as the liaFSR genes already described in the literature. The findings of this study have a particular importance considering that vancomycin-resistant E. faecium infections have grown frighteningly in the present day. The lafB-like gene may be a potential therapeutic target and should be better studied for this.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Enterococcus spp. são um dos mais importantes pátogenos nosocomiais multirresistentes. As infecções por enterococos resistentes à vancomicina (VRE, do inglês, Vancomycin Resistant Enterococci) estão cada vez mais difíceis de se tratar, geralmente com surtos hospitalares prolongados que são verdadeiros desafios. Daptomicina (DAP) é uma das últimas alternativas de tratamento para infecções causadas por VRE, principalmente E. faecium do complexo clonal 17, denominados “de alto risco”. Neste estudo, amostras de E. faecium do Hospital de Base de São José do Rio Preto foram analisadas por tipagem molecular e foi determinado o perfil de sensibilidade a diversos antimicrobianos. Um clone de alto risco resistente à vancomicina e com sensibilidade reduzida à daptomicina foi identificado se disseminando no hospital. O mecanismo de resistência à DAP ainda não está completamente elucidado. Com a finalidade de estudar o mecanismo de resistência à DAP nas amostras clínicas deste hospital e descobrir novas vias para esta resistência, a amostra E. faecium HBSJRP18 supersensível à DAP isolada neste hospital foi utilizada para realizar seleções in vitro até que se obtivesse linhagens mutantes resistentes. Posteriormente, os genes com mutação nestas amostras selecionadas, bem como aqueles já descritos na literatura, foram analisados nas amostras clínicas. Para isso, os genomas destes mutantes foram sequenciados e comparados com a supersensível HBSJRP18 para detectar a presença de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP, do inglês Single Nucleotide Polymorphism) em genes que podem estar relacionados à resistência a DAP. Os genes mutados/íntegros foram superexpressos na linhagem supersensível/resistente para que a CIM de DAP fosse determinada para investigar seus papéis na resistência a esse antibiótico. Os genes que apresentaram mutações nas três seleções em BHI foram lafB-like, uma glicosiltransferase possivelmente envolvida na biossíntese de LTA, e dhaK, uma dihidroxiacetona quinase possivelmente envolvida no metabolismo do glicerol. Clonagem e superexpressão dos genes de interesse foram realizadas, o que possibilitou a comprovação do papel do lafB¬-like na supersensibilidade à daptomicina. dhaK ainda permanece sem definição se realmente está envolvido com a resistência, pois a superexpressão do gene intacto na linhagem onde ele estava truncado não resultou em diminuição expressiva da CIM. Mutação nestes genes também foram encontradas em todas as amostras clínicas, bem como os genes liaFSR já descritos na literatura. Os resultados deste estudo têm uma importância particular, considerando que as infecções por E. faecium resistentes à vancomicina têm crescido assustadoramente nos dias atuais. O gene lafB¬-like pode ser um potencial alvo terapêutico e deve ser melhor estudado para tal