Structural and functional characterization of a xyloglucanase from Xanthomonas campestris

Xyloglucanases (Xghs) are important enzymes involved in xyloglucan modification and degradation. Xanthomonas campestris (Xcc) is a phytopathogenic bacterium which produces a large number of glycosyl hydrolases (GH), but has only one family 74 GH (Xcc-Xgh). A Xcc-Xgh xyloglucan-specific endo-β-1,4-glucanase from family GH74 has been cloned from the Xanthomonas campestris by expression cloning in E. coli. The recombinant enzyme was purified by resin another Ni-NTA column and gel permeation chromatography. The recombinant Xcc-Xgh is stable at pH of 5.3 and temperature below 40°C; the specific activity this enzyme were determined such as 9.31U/mg protein. This enzyme was purified and crystallized. Diffraction datasets were collected for native enzyme and its two complexs with glucose at maximum resolution of 2.0, 2.1 and 2.7 Å, respectively. Data were indexed in the hexagonal crystalline system with unit-cell parameters a=b=153.4 and c=84.9 Å. Data scaling indicated that crystals belong to either space group P61 or its enantiomorph P65. Translation search in molecular replacement calculations solved the space group ambiguity (P61) and the structure refinement is currently in progress. That elucidation of the three-dimensional structure by SAXS and Crystallography of this enzyme will increase our understanding of structure function relationships of the GH74 family members and might provide new structural insights about xyloglucanases mode of action on xyloglucan polysaccharides.Universidade Federal de Sao CarlosXiloglucanases (Xghs) são enzimas envolvidas na degradação da parede celular vegetal pela modificação do polissacarídeo xiloglucano. Xanthomonas campestris (Xcc) é uma bactéria fitopatogênica que produz um grande número de hidrolases de glicosídeos (GH) e apenas uma GH da família 74. Uma xiloglucanase Xcc-Xgh da família GH 74 foi clonada e expressa de forma heteróloga em E. coli. A enzima recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade Ni-NTA e separação por exclusão molecular. Essa enzima tem maior estabilidade funcional na temperatura 40 °C e pH 5,3; é específica para a hidrólise de xiloglucano e sua atividade específica determinada foi 9,31U/mg. Por meio de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foi possível determinar para duas diferentes construções desta enzima, uma com mutação e outra sem mutação, as curvas de estabilidade térmica diferentes para cada uma delas; isso reforça a estreita relação entre estrutura e função da presente enzima. Após a cristalização, conjuntos de dados de difração foram coletados para a enzima na forma apo e dois complexos com glicose na resolução máxima de 2,0, 2,1 e 2,7 Å, respectivamente. Os dados foram indexados no sistema cristalino hexagonal, com os parâmetros de célula unitária a=b =153,4 Å e c=84,9 Å. Os resultados do escalonamento indicam que os cristais pertencem ao grupo espacial P61 ou o seu enantiômero P65. A determinação estrutural por substituição molecular deixou claro que o verdadeiro grupo espacial é P61. Os ligantes de glicose obtidos por soaking com glicose pura e produtos da hidrólise de xiloglucano podem estar correlacionados com a atividade catalítica desta enzima. A determinação da estrutura tridimensional, como também os resultados funcionais, contribuem para a compreensão da maquinaria molecular das enzimas membros da família GH 74 e lança novas perspectivas estruturais sobre o modo de ação das xiloglucanases em polissacarídeos de xiloglucano