Clonagem e estudos de expressão de enzimas do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC-3844 envolvidas na degradação de biomassa

The plant biomass is a large-scale available resource and one of its more important applications is the second-generation ethanol production. However, the enzyme cost is one of the biggest barriers for economically viable ethanol from biomass. Therefore, it is important to identify fungal strains that can produce high concentrations of plant biomass-degrading enzymes. The aim of this work was to clone, study the gene expression and characterize the plant biomass-degrading transcript set of the filamentous fungus Trichoderma harzianum IOC-3844. A total of 1,543 highquality reads from the Trichoderma harzianum IOC-3844 cellulose induced cDNA library were organized into 1,002 transcripts representing 167 contigs and 835 singlets. Of these 1,002 transcripts 646 had unknown functions and 356 showed associated functions. Among the transcripts with associated functions, we found 20 transcripts related to plant biomass deconstruction. The real time PCR analysis of Trichoderma harzianum IOC-3844 mycelia grown for 36 and 60 hours in cellulose, revealed that the levels of the following mRNAs were induced by at least 2,000-fold when compared to uninduced mycelia: cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 and swo1. In some cases, the values were higher than 100,000-fold. Among the transcripts analyzed by real time PCR, cbh1, cbh2 and egl7 exhibited the highest expression levels. The Trichoderma harzianum IOC-3844 exhibited a repertoire with high expression of plant biomassdegrading transcripts. The enzymes EGIII and Xyn2 were recombinantly expressed in Pichia pastoris, showing good quality purification and good enzymatic activity. The heterologous expression assays made possible future studies aiming at the industrial application of the enzymes. Therefore, this strain showed potencial to produce biomassdegrading enzymes for second-generation ethanol production and to be a source of enzymes for the paper industryUniversidade Federal de Minas GeraisA biomassa vegetal é um recurso disponível em larga escala e uma das suas mais imporantes aplicações é a produção de etanol de segunda geração. No entanto, o custo das enzimas é um dos maiores entraves para a produção economicamente viável deste etanol. Neste contexto, é importante encontrar organismos produtores de grandes quantidades de enzimas que degradam a biomassa. Os objetivos deste estudo foram clonar, estudar a expressão gênica e caracterizar o conjunto de enzimas que degradam a biomassa vegetal, do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC-3844. Um total de 1.543 seqüências de boa qualidade, geradas a partir de uma biblioteca de cDNA do Trichoderma harzianum IOC-3844, induzido por celulose, foi organizado em 1.002 transcritos, sendo 167 representados por mais de uma seqüência e 835 representados por apenas uma seqüência. Destes transcritos, 356 tiveram função associada e 646 não tiveram. Com isso, entre os transcritos com função associada, foram listados 20 transcritos envolvidos com degradação de biomassa vegetal. Análises de PCR em tempo real do micélio de Trichoderma harzianum IOC-3844, crescido por 36 e 60 horas em celulose, mostraram níveis de mRNA mais de 2.000 vezes mais representados para os transcritos cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 e swo1, quando comparados com o micélio não induzido. Em alguns casos as maiores representatividades alcançaram valores superiores a 100.000 vezes. Entre os transcritos analisados o cbh1, o cbh2 e o egl7, mostraram os mais altos níveis de expressão. O Trichoderma harzianum IOC-3844 exibiu um repertório com alta expressão de transcritos envolvidas na degradação de biomassa vegetal. As enzimas EGIII e Xyn2 foram expressas em sistema recombinante com uso da levedura Pichia pastoris, apresentando facilidade de purificação e boa atividade enzimática. Os ensaios de expressão heteróloga viabilizaram estudos posteriores que visam a aplicação industrial das enzimas. Assim, esta cepa mostrou potencial para produzir enzimas que degradam a biomassa para a produção de etanol de segunda geração, e para ser fonte de enzimas para a indústria de papel