Isolation, Purification, and Characterization of Antimicrobial Substances from Endophytic Actinomycetes

Abstract   Antimicrobial active substances produced by endophytic actinomycetes were isolated and purified. Plant samples were obtained from four different medicinal plants namely Curcuma domestica, Phaleria macrocarpa, Isotoma longiflora, and Symplocos cocchinensis. Isolation of actinomycetes was conducted using HV agar with the addition of cycloheximide, nystatin, nalidixic acid, and rifamycin. A total of 21 actinomycete isolates were obtained and tested for antimicrobial activity against Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, and Bacillus subtilis ATCC 66923. Among the isolates, isolate KY01 was the most active to Gram-positive and Gram-negative bacteria. Morphological observation and identification using 16S rRNA gene sequence showed that the isolate KY01 was similar to Streptomyces antibioticus. An active compound from the isolate KY01 was produced using yeast peptone medium. The active compound was purified using silica-gel-column chromatography and preparative high performance liquid chromatography (HPLC). A single peak of the active compound was detected with HPLC and LCMS, which showed a retention time of 26.6 min and molecular weight (MW) 906.4474 g/mol, respectively.     Abstrak   Isolasi, Purifikasi, dan Karakterisasi Senyawa Antimikroba dari Aktinomisetes Endofit. Isolasi dan purifikasi senyawa aktif anti mikroba yang dihasilkan oleh aktinomisetes endofit telah dilakukan. Sampel tanaman diperoleh dari empat jenis tanaman obat yaitu Curcuma domestica, Phaleria macrocarpa, Isotoma longiflora, dan Symplocos cocchinensis. Isolasi aktinomistes endofit dilakukan dengan menggunakan medium HV agar dengan penambahan antibiotik sikloheksimida, nistatin, asam nalidik, dan rifamisin. Sebanyak 21 isolat aktinomisetes diperoleh dari sampel tanaman obat yang selanjutnya diuji aktivitas antimikroba terhadap Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, dan Bacillus subtilis ATCC 66923. Hasil pengujian pada 21 isolat yang diperoleh, isolat KY01 menunjukkan aktivitas antimikroba paling kuat terhadap bakteri Gram-positif maupun bakteri Gram-negatif. Pengamatan secara morfologi dan identifikasi menggunakan sequence gen 16 rRNA menunjukkan bahwa isolat KY01 memiliki kemiripan dengan Streptomyces antibioticus. Produksi senyawa aktif isolat KY01 dengan kultur cair menggunakan medium yeast pepton. Purifikasi senyawa aktif dari ekstrak fermentasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom silica gel dan HPLC preparatif. Hasil identifikasi menggunakan HPLC menunjukkan puncak dengan waktu retensi 26,6 menit dan hasil karakterisasi senyawa aktif menggunakan LCMS menunjukkan bobot molekul senyawa aktif sebesar  (MW) 906,4474 g/mol.   Keywords: endophytic actinomycetes, isolation, screening, antimicrobial activity, purificatio