Molecular mechanisms underlying the role of SynGAP in cognition and synaptopathies

Les densitats postsinàptiques (DPSs) de les sinapsis en espines dendrítiques expressen més de 2.000 proteïnes, dotant a les neurones de plasticitat sinàptica necessària per a la cognició i el comportament. Algunes de les proteïnes més abundants de la DPS són SynGAP i les Shanks. En ratolins, similar a altres mamífers, el gen Syngap1 codifica per diferents isoformes que varien en el seu N- i C-terminal. Mutacions en SYNGAP1 humà causa un forma de retard mental autosòmic de tipus 5 (de l’anglès MRD5), el qual es caracteritza per discapacitat intel·lectual (DI), epilèpsia i en aproximadament un 50% dels casos, trets autistes entre altres alteracions. La primera part d’aquesta tesi es va centrar en l’estudi de les isoformes de SynGAP durant el desenvolupament de ratolí. Usant diferents mètodes, es va quantificar l’abundància relativa i/o absoluta del total de SynGAP i de les isoformes compostes per les variants C-terminal alpha1, alpha2 o beta en cinc àrees cerebrals i quatre estadis diferents del desenvolupament. A més, es va investigar la seva distribució subcel.lular en edats post-natals similars a les anteriors analitzades, alhora que es va confirmar l’expressió d’aquestes isoformes en escorça d’humans. El conjunt d’aquests experiments varen permetre identificar una regulació espacio-temporal i distribució subcel.lular diferencial de SynGAP i les seves isoformes. L’expressió de SynGAP-α1 era restringida a la PSD, mentre que la variant β predominava en el citosol, fins i tot en edat adulta. Les isoformes compostes d’α2 mostraren un patró d’expressió i distribució intermedi al de les altres variants C-terminal. Concretament, SynGAP-α2 predominava en el citosol fins a dia post-natal 21 (DPN21), a partir d’on la seva expressió seria majoritària en la PSD. Atès que en etapes primerenques del desenvolupament SynGAP-β i -γ s’han trobat expressades amb major abundància en comparació a les altres variants, podrien tenir un rol principal en aquests estadis. La segona part d’aquesta tesi adreçà l’estudi de les alteracions del proteoma de la PSD derivades de l’haploinsuficiència de Syngap1 en hipocamp. El rescat d’aquestes alteracions va ser també investigat en ratolins modificats genèticament per a Syngap1+/- , així com els efectes d’una reducció de SynGAP a la DPS, en ambdós casos a DPN21. Aquests estudis revelaren que els nivells de proteïnes relacionades amb la traducció, la producció d’energia, i les ‘small GTPases” entre altres anomalies, estarien significament alterades en ratolins Syngap1+/- . A més, en recuperar l’expressió normal de SynGAP a partir de DPN21, el ~83% de les alteracions observades van ser revertides. No obstant, algunes alteracions romangueren mentre que altres aparegueren com a conseqüència de la reactivació de Syngap1 en els ratolins rescatats. Aquestes desregulacions feien referència majoritàriament a processos de proteostasis amb un clínica menys severa que en els ratolins no rescatats. La inducció de la reducció de SynGAP a partir del DPN21 també va resultar en canvis dels nivells d’un nombre similar de proteïnes però amb un baix grau de solapament i efecte aparentment menys deleteri que en el cas de ratolins haploinsuficients des de la embriogènesis. Finalment, es van dur a terme experiments dirigits a desenvolupar ratolins modificats genèticament per a Shank2+/- que alhora permetessin estudis de rescat genètic, ja que mutacions en la família de gens SHANK en humans son potencials causes d’autisme monogènic i altres desordres del neurodesenvolupament tals com la DI.Forebrain postsynaptic densities (PSDs), found in dendritic spines, express more than 2,000 different proteins, endowing neurons with the synaptic plasticity mechanisms required for cognition and behaviour. Some of the most abundant PSD proteins are SynGAP and Shanks. In rodents, like in other mammals, the Syngap1 gene encodes for different isoforms that vary in their N- and C-termini. Mutations in the SYNGAP1 gene cause autosomal mental retardation type five (MRD5), which is characterized by intellectual disability (ID) and epilepsy, as well as autistic traits in approximately half of the affected individuals, among other impairments. The first part of the present thesis focused on the study of SynGAP isoforms during mouse neurodevelopment. Their differential abundance in five different brain regions and four developmental stages were systematically investigated using a variety of molecular approaches that allowed for their relative and absolute quantification. Furthermore, their sub-cellular distribution in similar neurodevelopmental stages and expression in human cortices were studied. This work indicated that out of the six previously unreported SynGAP variants identified in-silico, three and one were found expressed at the transcript or protein level, respectively. The expression of SynGAP isoforms carrying three out of the four C-terminal variants was also demonstrated in human cortex. Importantly, this work identified differential spatio-temporal regulation and subcellular distribution of SynGAP isoforms containing α1, α2 and β C-term variants. Specifically, the expression of SynGAP-α1 isoforms was found highly restricted to the PSD, while β isoforms predominated in the cytosolic fraction, even at PND56. Isoforms bearing the α2 C-term showed an intermediate pattern, having a primarily cytosolic location until PND21 but being mainly at the PSD afterwards. Interestingly, SynGAP-β and -γ isoforms could have a leading role in early stages of cortical development, as they were found particularly abundant compared to the other ones. The second part of this thesis addressed the study of the proteomic alterations derived from Syngap1 haploinsufficiency in the hippocampal PSD. The rescue of these alterations, as well as the effect of SynGAP ablation, both at PND21, was also investigated in two conditional Syngap1+/- mouse lines. These analyses revealed that proteins related to small GTPases, translation and energy production among others, were significantly altered in Syngap1+/- mice. In addition, ~83% of the alterations observed could be recovered if normal SynGAP levels were restored at PND21. Yet, some alterations persisted or newly arose in Syngap1+/- rescued mice. These alterations were mainly associated to protein processing at endoplasmic reticulum, transport of small molecules and proteasomal degradation. Based on gene set enrichment analyses, the molecular alterations observed after SynGAP rescue would be compatible with a less clinically severe scenario. Lastly, the induction of SynGAP deficit at PND21 resulted in a similar number of altered proteins as in embryonic Syngap1 haploinsufficiency, yet these two scenarios shared few affected proteins, suggesting a developmental role in the molecular alterations observed in the embryonic deficit of SynGAP. Finally, the present thesis also includes a series of experiments aimed at developing a Shank2+/- mouse model for genetic rescue experiments, as mutations in SHANK genes are a potential monogenic cause for ASD and other neurodevelopmental disorders, including ID