Capsaspora owczarzaki as a unicellular model to study the pre-metazoan integrin adhesome

Animal multicellular structure depends on three general mechanisms: cell adhesion, cell communication and cell differentiation. Some of these mechanisms were thought to be specific to animals. Genome sequencing of unicellular organisms that are closely related to animals has revealed that the unicellular ancestor of all animals already contained homologs of some of the genes that have a role in cell adhesion, cell communication and cell differentiation. Studying the function of these genes in their unicellular context is the way to infer the function they could have had in the ancestor, thus, helping us to understand how animals originated. Capsaspora owczarzaki, a filopodiated amoeba, is the closer unicellular relative of animals that contains key elements of the major cell-matrix adhesion system that animal cells use: the integrin adhesome. Thus, Capsaspora is an ideal model to study the origin of the integrin adhesome. However, the tools that would make feasible the experiments to study the function of these genes are not available. Therefore, this work has focused on developing molecular tools to work with Capsaspora, as well as understanding with other means the function of proteins related to the integrin adhesome. First, the life cycle of Capsaspora has been described at a cellular and molecular level. This revealed that the life stages of Capsaspora are transcriptomically regulated. Characterisation of its epigenome has revealed that these stages are regulated by some mechanisms which are shared with animals. In order to perform genetic studies, a transfection protocol based in calcium-phosphate precipitation has been established for Capsaspora. It was successfully used to label different structures of the cell with fluorescent tags, one of such allowed to visualise with unprecedented detail the filopodia in Capsaspora. As a first approach to the function of the integrin adhesome in Capsaspora, antibodies were designed to localise integrin adhesome proteins in the cell, and an adhesion assay was set up to analyse the adhesive potential of Capsaspora. Localisation of proteins in the filopodia and adhesion to fibronectin suggest that the integrin adhesome proteins in Capsaspora could be involved in adhesive function as in animals. The tools developed during this work are the first steps towards turning Capsaspora into a model organism to study the function of proteins involved in animal multicellularity.La multicelularidad animal depende de tres mecanismos generales: adhesión, comunicación y diferenciación celular. La secuenciación de los genomas de los organismos unicelulares emparentados con los animales han revelado que el ancestro unicelular de los animales ya contenía homólogos de algunos genes involucrados en estos mecanismos. Si estudiamos la función de estos genes en su contexto unicelular podremos inferir la función que podrían haber tenido en el ancestro de los animales, lo cual nos ayudará a entender cómo se originaron los animales a partir de este ancestro. Capsaspora owczarzaki, una ameba con filopodios, es, entre todos los parientes unicelulares de animales, el más cercano que contiene elementos clave del sistema de adhesión a la matriz extracelular más importante de animales: el adhesoma de integrina. Por lo tanto, Capsaspora es un organismo ideal para estudiar el origen del adhesoma de integrina. Las herramientas necesarias para llevar a cabo estos experimentos, sin embargo, no estaban disponibles. El trabajo realizado durante esta tesis se ha centrado en desarrollar herramientas moleculares para trabajar con Capsaspora, y en estudiar la función de las integrinas y otras proteínas relacionadas con el adhesoma de integrina en Capsaspora, con el fin de acercarnos a la función que podría haber tenido antes de que emergieran los animales. En primer lugar se ha analizado el ciclo celular de Capsaspora en cultivo, a nivel celular y molecular. Además se ha demostrado por primera vez en este organismo la existencia de un estadio agregativo. Comprobamos que las transiciones entre estadios están reguladas transcripcionalmente, y que en el estadio agregativo en concreto, los genes relacionados con la multicelularidad presentan una expresión más alta que en los otros estadios. Esto sugiere que en el ancestro unicelular de los animales, podría haber habido un mecanismo que permitiera la agregación celular y que fue reutilizado para dar lugar al actual sistema que emplean los animales durante su desarrollo. El epigenoma de Capsaspora también se ha analizado. Descubrimos que Capsaspora posee algunos mecanismos de regulación del genoma que comparte con animales, como modificaciones postranscripcionales de histonas y secuencias cis-reguladoras próximas a los genes. Los resultados también sugieren que los genes regulados en Capsaspora forman una red gobernada por factores de transcripción, como en animales. Sin embargo Capsaspora sólo posee un tipo de promotor, mientras que los animales tienen diferentes tipos de promotores (definidos por distintas marcas de histonas), y a su vez, carece de secuencias reguladoras distales, a diferencia de animales. Para poder estudiar la función de genes relacionados con multicelularidad en Capsaspora es necesario establecer herramientas genéticas. Con este fin, se ha desarrollado un protocolo de transfección reproducible y se han construido una serie de plásmidos que nos han permitido visualizar estructuras celulares de Capsaspora con fluorescencia. Por otro lado, y con el objetivo de estudiar la función del adhesoma de integrina en Capsaspora, se ha diseñado un ensayo de adhesión que nos ha permitido estudiar su capacidad de adhesión a distintas proteínas. También se han producido anticuerpos contra proteínas del adhesoma de integrina de Capsaspora para localizarlas en la célula. Estos últimos experimentos realizados nos aportan los primeros datos sobre la función de integrinas en un organismo unicelular, los cuales sugieren que las proteínas del adhesoma de integrina de Capsaspora están involucradas en adhesión, al igual que las de animales. En resumen, en este trabajo se han desarrollado herramientas genéticas y moleculares en un organismo no modelo que permitirá a la comunidad científica plantearse nuevas preguntas sobre el origen de animales