Desarrollo de procesos de producción de proteínas bioterapéuticas: Aumento de la productividad especifica en células HEK293

La tesis doctoral se basa en la producción de proteinas recombinantes bioterapéuticas mediante el cultivo de células de mamífero. El trabajo realizado ha consistido en la obtención de células de riñón embrionario humano (HEK293) modificadas genéticamente para producir dos proteinas bioterapéuticas candidatas, el interferón gamma y el anticuerpo monoclonal trastuzumab. El objetivo principal del trabajo ha sido la mejora de las líneas celulares obtenidas, con el fin de aumentar la productividad especifica de las mismas. Durante el desarrollo del trabajo se han usado diversas aproximaciones para de conseguir este objetivo. Durante el capítulo 3 se ha realizado la construcción de las células productoras, comprobando que expresan los productos de interés y poniendo a punto las diversas técnicas necesarias para su cultivo. En el capítulo 4 se han evaluado diferentes elementos genéticos que regulan la expresión y la secreción de las proteinas recombinantes (Promotores y péptidos señal), encontrándose como elementos óptimos el promotor CMV y el péptido señal del interferón alfa-2. Con estos elementos se ha conseguido multiplicar por 5 la producción específica del anticuerpo monoclonal trastuzumab. En el capítulo 5, se ha explorado un elemento genético de gran importancia para la obtención de líneas celulares recombinantes, el marcador de selección basado en genes metabólicos. Estos marcadores son ampliamente usados en la industria biofarmacéutica, para seleccionar las células más productoras dentro de una población determinada sin necesidad de usar antibióticos para ello. Sin embargo, su aplicación en células HEK293 se ve dificultada por la expresión de enzimas endógenas que interfieren con los marcadores comercialmente disponibles. Los resultados obtenidos durante este capítulo han permitido la definición de dos marcadores de selección: La enzima fenilalanina hidroxilasa, aplicable a las células HEK293 no modificadas y la glutamina sintetasa, aplicada a células HEK293 mutantes obtenidas mediante CRISPR/Cas9. El uso de este último marcador, en combinación con un inhibidor, ha permitido una mejora de entre 3 y 5 veces en la producción de interferón gamma y de trastuzumab, en comparación con el marcador basado en antibióticos. En el capítulo 6 se ha explorado y desarrollado un método para integrar en el genoma de la célula HEK293, de forma dirigida, el vector que contienen el gen que codifica para las proteinas de interés. Para ello, se ha construido y caracterizado un sitio genómico de alta transcripción mediante el uso de la proteína verde fluorescente (eGFP), para, posteriormente, integrar en dicho lugar el transgen usando el sistema CRISPR/Cas9. Los resultados obtenidos demuestran que la técnica ensayada permite la integración dirigida en el punto deseado del ADN genómico de la célula, habiéndose logrado duplicar la producción especifica de interferón gamma y aumentando la producción de trastuzumab en un 30%. Finalmente, durante el capítulo 7 se ha llevado a cabo un estudio de escalado en la producción de interferón gamma usando biorreactores como paso previo a una potencial aplicación industrial. Se ha realizado un análisis de las condiciones fisiológicas de cultivo en biorreactor, habiendo sido necesario optimizar la concentración de CO2 y el pH con el fin de conseguir un proceso escalable desde el cultivo en matraz hasta el biorreactor y demostrando que las células HEK293 cultivadas en biorreactor necesitan una mínima cantidad de CO2 para conseguir un metabolismo optimo y mantener la productividad especifica. El proceso resultante ha sido escalado usando un reactor preindustrial de un solo uso de 50L. Se puede concluir, a tenor de los resultados obtenidos y, dada la variedad de modelos ensayados, que las técnicas desarrolladas resultan interesantes de cara a una posible aplicación en la producción de diferentes proteinas recombinantes de interés bioterapéutico, sector de gran importancia económica e industrial.The thesis is focused on the production of recombinant proteins of biotherapeutic interest using mammalian cell culture. During the work, several human embryonic kidney-based (HEK293) cells lines has been developed, applying genetic engineering techniques, to produce two candidate biotherapeutics: the cytokine Interferon gamma and the monoclonal antibody Trastuzumab. The main goal of the work has been the genetic improvement of the cell lines obtained, in order to increase the specific productivity of the candidates. Throughout the work, diverse approaches have been used to achieve this goal. Firstly, during the third chapter, development of productive cells was carried out, checking correct expression of products of interest and good practice of cell culture techniques. Afterwards, in chapter 4, different genetic elements regulating the expression and secretion of recombinant proteins (Promoters and signal peptides) were evaluated, finding CMV promoter and interferon alpha-2 signal peptide being the optimal elements. By using these elements, a 5-fold increase in specific productivity of trastuzumab expressing cells has been achieved. In Chapter 5, the metabolic selectable marker, a key genetic element in cell line development, has been explored. These markers are widely used in the biotherapeutics manufacturing industry, in order to select the most productive cells within a given population avoiding the use of antibiotics. However, its application in HEK293 cells is hampered by the expression of endogenous genes that interfere with commercially available markers. The results obtained during this chapter have allowed the definition of 2 selectable markers, one based on the enzyme phenylalanine hydroxylase, applicable to conventional HEK293 cells and another based on glutamine synthetase, applied to mutant HEK293 cells obtained by gene editing using CRISP/Cas9 technology. The use of glutamine synthetase, in combination with an inhibitor, has elicited a 3 to 5-fold increase in trastuzumab and interferon gamma production, in comparison with antibiotic resistance marker During Chapter 6, a targeted- integration method has been explored and developed to insert the vector containing the gene of interest into a particular location into HEK293 genome. To this purpose, a high transcription genomic site has been characterized using green fluorescent protein (eGFP), in order to integrate the construct of interest via CRISPR/Cas9. The technique developed in this chapter allows targeted-integration of transgenes into the expected site of genomic DNA of the host cell, doubling the specific production of interferon gamma and increasing the production of trastuzumab by a 30%. Finally, during chapter 7, we carried out a scale-up study on interferon gamma production using bioreactors, as previous step towards a potential industrial application. A complete analysis of the physiological conditions of culture in bioreactor has been conducted, being necessary an optimization of CO2 feeding and pH levels in order to achieve a scalable process from the shake flask to the bioreactor. These findings prove that HEK293 cells cultured in bioreactor need a minimum amount of CO2 to achieve an optimal metabolism, while maintaining specific productivity. The productive process has been successfully tested at pilot scale using a 50L single use bioreactor. It can be stated that, based on the results obtained and given the variety of models tested, the methods developed are potentially applicable to the production of different recombinant proteins of biotherapeutic interest, a sector of great economic and industrial significance