Mantle cell lymphoma pathogenesis: another turn of the screw to cyclin D1 overexpression

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm derived from mature B cells characterized by the presence of the t(11;14)(q13;q32) translocation that leads to the overexpression of Cyclin D1. Cyclin D1 plays a well-established role in G1/S progression, although other functions including transcription or DNA damage response (DDR) can be regulated by this cyclin. Therefore, the main goal of this thesis is the characterization of the cyclin D1 non-canonical function in MCL and lymphoid cells. Firstly, we analyzed the genomic binding of endogenous cyclin D1 in four MCL cell lines, showing widespread occupancy around the transcription start site of active promoters. Overexpressed cyclin D1 in lymphoblastic cell lines causes a global transcription downmodulation, while cyclin D1 silencing increased the RNA content. In addition, higher levels of cyclin D1 correlated with lower transcription outputs in MCL and multiple myeloma cell lines. We also found that cyclin D1 colocalized with Pol II, but its overexpression increased the RNA polymerase II pausing and decreased elongation. Cyclin D1 overexpressing cells showed higher sensitivity to transcription inhibitors, revealing a synthetic lethality interaction. As expected, MCL and multiple myeloma cell lines displaying higher levels of cyclin D1 were more sensitive to the effects of the drug. Next, we studied the capacity of cyclin D1 to induce DNA replication stress in lymphoblastic cell lines. Cyclin D1 overexpression caused increased cell proliferation, especially the mutant form cyclin D1 T286A that codifies for a more stable protein. However, cyclin D1 overexpressing cells displayed a slower progression through S-phase. The analysis of DNA fibers showed that cyclin D1 overexpression caused DNA replication stress. Indeed, constitutive overexpression of cyclin D1 led to basal DDR activation, which was detected by the induction of γH2AX and pCHK2 phosphoproteins. These results led us to wonder if MCL can display a high, constitutive hyperactivation of DDR in primary samples. Concordantly, 66% showed positive γH2AX staining and 33% of all cases showed a concomitant pCHK2expression. The activation of DDR correlated to worse survival, more chromosome abnormalities, higher proliferation and genetic alterations of genes involved in the DDR. Finally, we aimed to study the potential contribution of altered DNA methylation in the development and/or progression of MCL. To do so, we performed genome-wide methylation profiling of a large cohort of primary MCL tumors and normal lymphoid tissue samples. Primary MCL displayed a heterogeneous methylation pattern dominated by DNA hypomethylation when compared to controls. Annotation analysis of hypermethylated promoters recognized pathways related to cell proliferation. The promoters of WNT pathway inhibitors and several other tumor suppressor genes were shown frequently methylated. A substantial fraction of the genes with promoter hypermethylation showed a significant downregulation of their transcription levels. Furthermore, we identified a subset of tumors with extensive CpG methylation that had an increased proliferation signature, higher number of chromosomal alterations and poor prognosis. Our results suggest that a subset of highly proliferative MCL cases displays a dysregulation of DNA methylation characterized by the accumulation of CpG hypermethylation that may influence the clinical behavior of the tumors. Overall, we have characterized for the first time the new functions that cyclin D1 performs in transcription and replication stress in MCL. The elucidation of these mechanisms may be useful not only for a better understanding of the tumor, but also for improving diagnostic and treatment of MCL patients. A subset of aggressive cases displayed dysregulated DDR and higher methylation levels and were associated with higher proliferation. Our findings suggest that cyclin D1, in addition to its canonical role in cell cycle regulation, plays other functions that may be important for MCL lymphomagenesis.Les neoplàsies limfoides són un grup heterogeni de tumors que, en molts casos, es caracteritzen per un esdeveniment genètic inicial i l'acumulació de canvis moleculars secundaris que condicionen la progressió tumoral. Freqüentment, les alteracions genètiques primàries són translocacions cromosòmiques que provoquen la sobreexpressió aberrant d'un oncogen. Aquest primer esdeveniment oncogènic altera la proliferació, l'apoptosi o la diferenciació normal linfoide que determinen de forma essencial la biologia del tumor. El limfoma de cèl·lules del mantell (LCM) és un subtipus de neoplàsia limfoide madura amb un curs clínic en general poc favorable i baixa supervivència. Aquest limfoma es caracteritza genèticament per la translocació t(11; 14)(q13; q32) i la conseqüent sobreexpressió de ciclina D1. De fet, l'estudi immunohistoquímic de la cicina D1 s'ha convertit en una eina imprescindible per a realitzar el diagnòstic diferencial d'aquest limfoma, atès que l'expressió d'aquest oncogen en neoplàsies limfoides es limita a la pràctica totalitat de casos de LCM i un percentatge baix de casos de mieloma múltiple (MM) i la tricoleucèmia. S'han descrit dues variants citològiques principals de LCM: clàssica i blastoide. Les formes blastoides generalment presenten una major proliferació i cariotips més complexos. La identificació en els últims anys de casos de LCM que no mostren els criteris convencionals ha complicat la classificació dels LCM fent necessari un diagnòstic basat en criteris clínics, histomorfológics, citogenètics i moleculars. Dins d'aquest grup s'enquadra un conjunt de pacients amb LCM i que presenten un curs clínic indolent sense necessitat de tractament durant un temps relativament llarg. Aquesta variant específica de LCM s’anomena limfoma de célules del mantell leucèmic no-nodal. La identificació d'aquest grup de pacients és important perquè es podrien beneficiar d'aproximacions terapèutiques més conservadores sense que es produeixi un impacte negatiu en la seva supervivència global. A més de la t(11; 14)(q13; q32) com alteració oncogènica inicial, la majoria de casos presenten, en comparació amb altres limfomes, un nombre elevat d'alteracions cromosòmiques secundàries. Els gens dianes de moltes d'aquestes alteracions cromosòmiques s’han identificat i en molts casos corresponen a gens implicats en el control del cicle cel·lular i en els mecanismes de resposta i reparació de l'ADN. El gen que codifica per a la proteïna ciclina D1, CCND1, és un dels oncogens més freqüentment amplificats en tumors humans, especialment en tumors de mama o de vies respiratòries. A més, tumors hematològics tenen mecanismes genètics que també causen la sobreexpressió d'aquest oncogen, com la translocació t(11; 14) en MCL i MM. Així mateix, ciclina D1 es troba sobrexpresado en una gran varietat de càncers diferents, com fetge, colon, melanoma o pàncrees; mitjançant altres mecanismes no genètics. Funcionalment, ciclina D1 juga un paper essencial en la transició G1 / S en el cicle cel·lular. Ciclina D1 s'expressa com a resposta a estímuls mitogènics. La seva unió amb les quinases dependents de ciclina (CDK) 4 i 6 determina l'activació d'aquestes últimes, que s'encarreguen de la fosforilació de la proteïna RB. Quan RB no està fosforilat, s'uneix i inactiva els factors de transcripció (TF) de la família E2F. No obstant això, la fosforilació de RB canvia la conformació de la proteïna i permet que les proteïnes E2F activin la transcripció de gens de fase S i que se superi el punt de restricció en el cicle cel·lular. Per això es considera que la principal funció oncogènica de ciclina D1 estaria relacionada amb el seu paper en la progressió a la fase S, que determinaria un augment de la proliferació cel·lular. No obstant això, cada vegada són més les evidències que mostren que ciclina D1 pot estar participant en altres funcions, moltes d'elles independents a la seva unió amb CDK4 / 6. S'han trobat més de 30 proteïnes que interaccionen amb ciclina D1, regulant processos com la transcripció, la reparació del ADN, apoptosi, migració i metabolisme mitocondrial. No obstant això, molts dels estudis utilitzen la sobreexpressió de ciclina D1 exògena i / o han estat únicament validats en pocs models. A més, no està clar si aquestes funcions tenen lloc tant en cèl·lules neoplàsiques com teixit normals, o fins i tot si són pròpies de determinats teixits. L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral és la caracterització de funcions no canòniques que ciclina D1 pogués exercir durant la linfomagènesi del LCM. En aquest projecte de tesi ens hem centrat en l'estudi del possible paper de ciclina D1 com a regulador de la transcripció (Estudi 1) i de la capacitat d'induir estrès replicatiu i dany a l'ADN (Estudi 2). L'alteració d'aquests processos, juntament amb la d'altres mecanismes ja descrits en el LCM, poden ser tant causa com conseqüència de la desregulació epigenòmica en cèl·lules tumorals. Per tot això, també és un objectiu d'aquesta tesi la caracterització dels canvis de metilació en una cohort àmplia de casos de LCM (Estudi 3). En l'estudi 1 es va analitzar el patró d'unió que ciclina D1 mostra en quatre línies cel·lulars de LCM mitjançant tècniques d'immunoprecipitació de cromatina i seqüenciació (ChIP-Seq). Inesperadament, identificarem més de 40.000 regions genòmiques que van mostrar interacció amb ciclina D1 endògena. Aquestes regions d'interacció amb ciclina D1 van mostrar estar enriquides en seqüències promotores. També analitzem diverses marques d'histones i els llocs de sensibilitat a ADNsa I en els promotors units per ciclina D1. Amb aquestes anàlisis identifiquem que ciclina D1 s'uneix d'una manera global a tots els gens amb transcripció activa. Aquesta conclusió va ser corroborada amb dades de seqüenciació de RNA (RNA-Seq). De fet, unions més fortes de ciclina D1 amb un promotor correlacionaven amb nivells més alts de transcripció del gen. Aquest patró d'unió és molt similar al que fa uns anys s'havia descrit per l'oncogen MYC, que es va definir com un amplificador transcripcional. Es va observar que Myc també s'unia especialment a una gran quantitat de promotors, correlacionava amb els nivells d'expressió i amb marques epigenètiques d'activació. La sobreexpressió de MYC causava l'amplificació del contingut global de RNA, de manera que nosaltres decidirem quantificar l'efecte de ciclina D1 sobre els nivells de RNA total cel·lular. Sorprenentment, els nivells de RNA disminuïen en models linfoblàstics quan es sobreexpressava la forma normal de ciclina D1 o la variant amb la mutació T286A, que li atorga major estabilitat i provoca majors nivells de ciclina D1 nuclear. Aquest efecte sobre la transcripció ho confirmarem mitjançant el silenciament de ciclina D1 en línies de LCM, que va causar un augment en la quantitat total de RNA. A continuació, vam comprovar en línies de LCM i MM que la concentració de ciclina D1 correlacionava amb nivells més baixos de transcripció, indicant que la ciclina D1 endògena estaria comportant-se igual que l'exògena. Mitjançant la utilització de mètodes de quantificació digital confirmarem que la sobre expressió de ciclina D1 també determinava una disminució dels nivells de RNA missatger. El nostre següent objectiu es va centrar en determinar el mecanisme pel qual ciclina D1 exerceix el seu efecte sobre la transcripció. Per a això ens centrem en l'estudi de la maquinària transcripcional i la seva relació amb la sobreexpressió de ciclina D1. Mitjançant anàlisi de ChIP-Seq de la polimerasa II (Pol II) vam determinar que els nivells de ciclina D1 en els promotors correlacionava amb els de Pol II. De fet, varem trobar que la sobreexpressió de ciclina D1 incrementava la parada de la polimerasa, especialment en aquells gens que unien més quantitat de ciclina D1 al seu promotor. Aquesta parada correlacionava amb un canvi en el patró de fosforilació de la polimerasa II, observant una disminució significativa de la fosforilació Ser5 de Pol II. Aquesta fosforilació s’associava amb l'activació de l'elongació i en conseqüència observarem un augment de l'índex de parada de la Pol II. Com la fosforilació Ser5 és depenent de CDK9, vam decidir comprovar si l'efecte de ciclina podria ser a través la unió a CDK9. Després d'observar que ciclina D1 s'unia a aquesta proteïna, vam comprovar si la sobreexpressió de ciclina D1 en models linfoblàstics augmentava la sensibilitat al 5, 6-dicloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole (DRB) , un inhibidor específic de CDK9. La nostra hipòtesi era que podria existir una letalitat sintètica en aquells casos amb més ciclina D1 i, per tant, menors nivells de transcripció. Conseqüentment, vam comprovar que línies amb majors nivells de transcripció i nivells inferiors de ciclina D1 eren menys sensibles a l'inhibidor. Atès que la inhibició de CDK9 s'aconsegueix a dosis molt altes de DRB i, per tant, l'inhabilita per a la seva administració terapéutica, utilitzarem una droga anomenada triptolide utilitzada en assaigs clínics i que produeix una inhibició de la transcripció. Com esperàvem, en línies cel·lulars de LCM i MM, la inhibició de la transcripció és un bon candidat per a desenvolupar noves estratègies terapèutiques contra tumors de baix potencial transcripcional / alta concentració de ciclina D1. L'objectiu de l'estudi 2 va ser estudiar in vitro l'efecte de ciclina D1 sobre la replicació en el limfoma de les cèl·lules del mantell. Ciclina D1 va demostrar ser capaç d'augmentar la proporció de cèl·lules en fase S, però inhbitint la seua progressió durant la fase S. Les cèl·lules amb sobreexpressió de ciclina D1 mostraven clars defectes durant la fase S. Primer, vam comprovar que la fase S era més lenta en aquelles cèl·lules ciclina D1 positives. A més, vam detectar per primera vegada que ciclina D1 estava causant problemes en la progressió de les forquilles de replicació en models de cèl·lula B. Entre aquests problemes destaquem la disminució de la velocitat de progressió de la forquilla de replicació, un increment del nombre de nous orígens activats, la reducció del percentatge de forquilles amb elongació activa i l'augment de forquilles bloquejades. A més, també vam detectar la presència d'una població de forquilles asimètriques en el cas de la sobreexpressió de ciclina D1. També hem observat que la sobreexpressió de ciclina D1 pot comprometre la recuperació de les cèl·lules a un estrès que generi una parada de les forquilles, per exemple després del tractament amb hydroxyurea. Les cèl·lules que sobrexpressaven ciclina D1 van mostrar major apoptosi que les ciclina D1 negatives. Tot això ens va fer concloure que els nivells de ciclina D1 causen estrès replicatiu en línies cel·lulars limfoblàstiques. Tots els resultats antreriors ens fan pensar que el paper de ciclina D1 en la linfomagènesi del LCM va més enllà que el seu efecte en l'increment de la proliferació. L'estrès replicatiu pot causar inestabilitat genòmica i activació dels mecanismes de resposta al dany al ADN, per tant vam estudiar els efectes després d'una setmana d'inducció de ciclina D1, observant que s'incrementava la quantitat de proteïna H2AX i CHK2 fosforilades, marcadors d'aquesta activació del dany causada per ciclina D1. A banda, ciclina D1 augmentava significativament la proporció de cel·lules tetraploids. A continuació, donat que el LCM es caracteritza per alts nivells de ciclin D1, volguerem analitzar si els casos primaris d’aquest càncer expressaven marcadors de dany a l'ADN i dels mecanismes de resposta. Estudiarem mitjançant immunohistoquímica l'expressió de les formes fosforilades de H2AX i CHK2 en mostres primàries de MCL.24/37 (64.9%) del casos tenien activació de H2AX, mentre 14/24 (58.3%) tenien activació concomitant de CHK2. Això ens permet distingir casos amb alta activació de la resposta a dany al ADN (ambdues proteïnes fosforilades) o amb baixa / nul·la activació de la resposta a dany al ADN. El grup amb major dany a l’ADN presentava més anormalitats cromosòmiques, menor supervivència i més alteracions en gens supressors de tumors com CDKN2A o TP53. Així mateix, aquests casos també eren els més proliferatius (major Ki67). La caracterització de les alteracions epigenómicas al LCM es va desenvolupar en profunditat en l'estudi 3. Es va realitzar un estudi de metilació amb la plataforma HumanMethylation27 BeadChip de 132 casos primaris de MCL i 6 línies cel·lulars. En aquest estudi vam poder observar que el LCM és un limfoma molt heterogeni i que mostra un gran nombre d'anormalitats epigenètiques quan es compara amb un teixit normal. Curiosament, els fenòmens de hipermetilació i hipometilació de novo van mostrar diferents comportament. La hipometilació es concentrava en regions intergèniques, mentre la hipermetilació apareixia freqüentment associada a promotors. De fet, es van identificar un total de 454 gens amb promotors hipermetilats i 875 gens amb promotors hipometilats en almenys el 10% dels casos. En el nostre estudi vam observar que la hipermetilació s'associava amb una reducció de l'expressió, afectant freqüentment a gens supressors de tumors. Així, els promotors hipermetilats corresponien a gens que regulaven processos com la proliferació cel·lular i altres vies de senyalització com la via de WNT, de la qual molts dels seus inhibidors estaven de novo hipermetilats. Aquest fenomen suggeriria la inactivació oncogènica mitjançant hipermetilació de gens supressors de tumors en casos primaris de LCM. L'anàlisi dels fenòmens d’hipermetilació ens va permetre caracteritzar un subgrup de casos que presentaven un major nombre de ecanvis epigenètics, un major percentatge d'alteracions genètiques i una menor supervivència global. Especialment destacable és el fet que aquest grup de casos mostraven també una elevada signatura de proliferació. Consistent amb aquests resultats, el gen supressor de tumors CDKN2A es trobava hipermetilat i inactivat en un gran nombre de casos. Globalment, els nostres resultats suggereixen que la desregulació de l'epigenoma al LCM pot ser una conseqüència d’una proliferació descontrolada, en part per la sobreexpressió de ciclina D1, i l'adquisició de determinades epimutacions que poden participar en la progressió tumoral. Les conclusions d'aquest projecte de tesi doctoral han estat: 1) Ciclina D1 mostra un patró global d'unió al la cromatina, unint-se preferentment a promotors de gens actius i que correlaciona de manera significativa amb el nivell de transcripció del gen. 2) Ciclina D1 es comporta com un regulador negatiu global de la transcripció tant en cèl·lules de MCL com en models linfoblàstoids. 3) La sobreexpressió de ciclina D1 incrementa la parada de la Pol II al promotor i dificulta l'elongació, probablement a través de la seva unió inactivant amb CDK9. 4) Els inhibidors de la transcripció induixen apoptosis en línies cel·lulars de MCL, MM i en models linfoblàstoids de sobreexpressió de ciclina D1, suggerint que aquesta letalitat sintètica pot representar una nova estratègia terapèutica per al tractament de limfomes agressius amb nivells alts de ciclina D1. 5) Ciclina D1 augmenta la proliferació cel·lular i l'entrada a fase S quan és expressada en línies limfoblàstiques. 6) La inducció de ciclina D1 provoca un augment significatiu moderat en la proporció de cèl·lules tetraploides en línies limfoblàstiques. 7) Les cèl·lules que sobrexpressen ciclina D1 presenten defectes en fase S i signes d'estrès replicatiu, manifestant parades de les forquilles de la replicació, activació de nous orígens, ralentiment de la replicació i requereixen de més temps per completar la replicació del ADN. En conseqüència, la sobreexpressió de ciclina D1 dificulta la recuperació cel·lular després d'un estrès replicatiu. 8) Temps llargs d'inducció de ciclina D1 activen els mecanismes de resposta al dany a l'ADN, fosforilant les proteïnes CHK2 i H2AX en cèl·lules limfoides. 9) El limfoma de les cèl·lules del mantell és un càncer caracteritzat per alts nivells d'activació de marcadors de resposta al dany a l'ADN, com γH2AX i pCHK2. 10) Els casos de MCL amb alts nivells d'activació de la resposta al dany a l’ ADN tenen pitjors taxes de supervivència i s'associen amb una major inactivació de gens supressors de tumors, amb morfologies més agressives i amb un índex de proliferació més gran. 11) L'anàlisi de la metilació de casos primaris de MCL indica que la hipermetilació es dirigeix essencialment a silenciar els promotors de gens supressors de tumors relacionats amb proliferació, per exemple les inhbidors de la via de WNT. 12) Els casos de MCL que tenen majors nivells de CpGs hipermetiladas s'associen amb un pitjor pronòstic, major nombre d'anormalitats cromosòmiques i major proliferació.Las neoplasias linfoides son un grupo heterogéneo de tumores que, en muchos casos, se caracterizan por un evento genético inicial y la acumulación de cambios moleculares secundarios que condicionan la progresión tumoral. Frecuentemente, las alteraciones genéticas primarias son translocaciones cromosómicas que provocan la sobrexpresión aberrante de un oncogen. Este primer evento oncogénico altera la proliferación, la apoptosis o la diferenciación normal linfoide que determinan de forma esencial la biología del tumor. El linfoma de células del manto (LCM) es un subtipo de neoplasia linfoide madura con un curso clínico en general poco favorable y baja supervivencia. Este linfoma se caracteriza genéticamente por la translocación t(11;14)(q13;q32) y la consecuente sobreexpresión de ciclina D1. De hecho, el estudio inmunohistoquímico de la cicina D1 se ha convertido en una herramienta imprescindible para realizar el diagnóst