Uptake and metabolism of the antiepileptic drug carbamazepine in plants and role of endophytic bacteria

Nuestro medio ambiente y reservas de agua reciben cada vez más productos de cuidado personal y fármacos. A pesar de una parcial degradación, algunos de estos compuestos presentan una eficiencia de eliminación muy baja en plantas convencionales de tratamiento de aguas residuales. En este contexto, el fármaco antiepiléptico carbamazepina (CBZ) es uno de los más recalcitrantes. Este producto se halla frecuentemente en aguas residuales, e incluso en los efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales después del proceso de purificación, llegando a aguas superficiales y, en algunos casos, a las reservas de agua potable. Debido al incremento demográfico especialmente en áreas urbanas, es previsible en un futuro próximo la necesidad del uso de aguas residuales tratadas en lugar de agua subterránea. Por lo tanto, la eliminación de compuestos recalcitrantes será muy necesaria en el futuro para aliviar el estrés sobre el ciclo hídrico, el medio ambiente y los consumidores. La fitorremediación es el tratamiento biológico de aguas residuales mediante plantas en humedales artificiales y representan una alternativa de bajo coste y sostenible para modernizar las plantas de tratamiento de aguas residuales existentes. Con esta tecnología, será posible eliminar estos contaminantes del agua residual tratada antes de su liberación al medio ambiente. Se ha puesto especial énfasis en el diseño de humedales artificiales para mejorar la eficiencia en la eliminación de compuestos peligrosos, incluyendo la selección de las especies vegetales más adecuadas o los programas de flujo hídrico. Otros estudios han considerado el papel de las comunidades microbianas del agua o de los sedimentos, pero se ha prestado poca atención a las comunidades endófitas asociadas a las plantas. Sin embargo, se ha demostrado recientemente la gran importancia del microbioma en el crecimiento de las plantas y su resistencia a estreses bióticos y abióticos. En este trabajo se estudia la absorción y el metabolismo de CBZ utilizando una aproximación conceptual holobióntica en la cual bacterias endófitas seleccionadas interactúan con las plantas en beneficio mutuo. Plantas de carrizo común (Phragmites australis) fueron cultivadas hidropónicamente en solución Hoagland bajo condiciones controladas. Después de exposición a CBZ (5 mg/L) durante 9 días, un 90% del compuesto fue eliminado. Se extrajeron las bacterias endófitas de las raíces y rizomas de estas plantas y se identificaron mediante secuenciación del 16S rRNA. Además, se estudiaron sus características promotoras del crecimiento vegetal y su capacidad de eliminar CBZ. Diaphorobacter nitroreducens y Rhizobium radiobacter fueron seleccionados entre las cepas aisladas para un estudio de la absorción y metabolismo de CBZ en las raíces utilizando un cultivo axénico de raíz en cabellera de Armoracia rusticana como modelo. Se identificaron un total de 13 productos de transformación mediante LC-QTOF-MS/MS. Estos metabolitos se clasificaron en 4 vías metabólicas diferentes. Un conjugado CBZ-glutatión fue detectado por primera vez en plantas. Armoracia rusticana preferentemente utilizó la vía del 10,11-diol y la del glutatión mientras que R. radiobacter y D. nitroreducens favorecieron las vías del 2-3-diol y de la acridina respectivamente. CBZ indujo respuestas antioxidantes en el sistema de raíz en cabellera. Observaciones similares fueran realizadas en la activitad de glutatión-S-transferasas. El análisis proteómico evidenció el papel protector de las bacterias endófitas mediante un estímulo de la respuesta antioxidante cuando las plantas se enfrentan a estrés abiótico. Podemos concluir que P. australis es una especie muy adecuada para la eliminación de CBZ en concentraciones relevantes desde un punto de vista ambiental y que esta degradación y eliminación del compuesto puede mejorarse a través del estímulo, de la presencia y funcionalidad de cepas beneficiosas seleccionadas entre la comunidad de bacteria endófitas.Our environment and our freshwater reserves suffer from increasing inputs of personal care products and pharmaceuticals. Despite partial degradation, some of these compounds have very low removal efficiency in conventional wastewater treatment facilities. The antiepileptic drug carbamazepine (CBZ) is one of the most recalcitrant compounds in this context. It is frequently found in wastewater, but also in the effluents of waste water treatment facilities after the treatment, reaches surface water and in some cases even drinking water reserves. With a growing urban population, forecasts are such that many of us will have to use reclaimed, treated wastewater instead of ground water. Hence, proper removal of recalcitrant compounds will be a necessity in the future to alleviate the stress put on the water cycle, the environment, and on consumers. Phytoremediation is the biological treatment of wastewater with plants in constructed wetlands and represents a cheap and environmental friendly alternative to retrofit existing waste water treatment facilities. With this technology it might be possible to remove these contaminants from treated wastewater before its release into the environment . Efforts have been put on the design of constructed wetlands to improve removal efficiencies of hazardous compounds, including the selection of best suited plant species or water flow regimes. Other studies have considered the role of microbial communities found in water or sediments, but little attention has been put into plant-associated and endophytic communities. However, the importance of the microbiome in plant fitness and resistance to biotic and abiotic stresses has been demonstrated recently. In this work, the uptake and metabolism of CBZ in plants is studied using a holobiontic conceptual approach in which plant and selected endophytic bacteria interact for mutual benefit. Common reed plants (Phragmites australis) were grown in liquid Hoagland solution under control conditions. After treatment with CBZ (5 mg/L) for nine days, up to 90% of the compound was removed. Endophytic bacteria were extracted from roots and rhizomes of these exposed plants, identified by 16S rRNA sequencing, and further characterized for their plant growth promoting traits and CBZ removal. Rhizobium radiobacter and Diaphorobacter nitroreducens were selected among the isolates for a comprehensive study of CBZ uptake and metabolism in interaction with plant roots. An axenic horseradish (Armoracia rusticana) hairy root (HR) culture was used as plant model to unravel which metabolic pathways are used for CBZ transformation by plants in the absence and presence of their endophytic partners. Inoculation with D. nitroreducens and R. radiobacter led to a 2-fold and 4-fold increase in the removal capacity oh HRs alone, respectively. In total, thirteen transformation products in the liquid media were identified by LC-QTOF-MS/MS. These metabolites were classified in four distinct metabolic pathways. For the first time, a CBZ-glutathione conjugate was detected in plants. Glutathione and 10,11-diol pathways were preferred by horseradish HRs while inoculation with R. radiobacter and D. nitroreducens favour the 2,3-diol and the acridine pathway respectively. A slight increase of ROS scavenging enzymes observed only in leaves tissues suggests that active metabolites formed in the root system by endophytic strains and plant cells are rapidly transported into the aerial part, inducing an antioxidant response in leaves followed by an increase in metabolic capacity of CBZ and its metabolites. GSTs were induced in rhizomes as well, indicating that the 10,11-diol and subsequent GSH pathways are the main metabolic pathways for CBZ degradation in P. australis. Antioxidant responses in HRs were induced by CBZ treatment but also after inoculation with endophytic bacteria. Similar observations were made on GST activities. The hypothesized protective role of endophytic bacteria when plants are confronted to abiotic stress by enhancing their antioxidant responses and detoxification mechanisms was evidenced by proteomics analyses. Superoxide dismutase, GR, monodehydroascorbate reductase, ascorbate peroxidase, all from the Halliwell-Asada cycle, were indeed identified in the growth media of inoculated roots. Additionally, proteomics results revealed a shift on HR metabolism from primary metabolism to structural and chemical defence processes after CBZ treatment. It can be concluded that P. australis is a species well-suited to remove CBZ at relevant environmental concentrations and that removal and degradation of the compound can be improved by enhancing the presence and functionality of selected beneficial strains among the endophytic bacterial community