Elucidation of the RecA-mediated mechanisms governing swarming motility in Salmonella enterica

RecA es una proteína multifuncional que, aparte de ser la recombinasa principal implicada en los pasos cenrrales de la recombinación homóloga y en los mecanismos de reparación de DNA,también es el activador de la respuesta SOS.RecA actúa como sensor de lesiones en el DNA.Al unirse a DNA monocarenario, la proteína se activa (RecA*)y promueve la auto-hidrólisis del represor lexA,induciendo asíla expresión de los genes de la respuesta SOS.Además,se ha descrito que la proteína RccA está también vinculada con la motilidad en enjambre. El movimiento en enjambre o swarming, que está. ampliamente distribuido en el dominio Bacteria, se defin.e como una translocación multicelular rápida y organiz.ada de lasbacterias sobresuperficies sólidas o semi.sólidasmediada por la rotación Aagclar. Varios estudios asocian la proteína RecA con CheW, un componente davc en el ensamblaje de los quirniorrecepcores y de las matrices de señalización formadas por éstos, queson.esenciales para el swarming. los resultadospresentados en la presente Tesis Doctoral demuestran inequívocamente la interacción entre RecA y CheW. En el desarrollo de éste trabajo se ha caracterizado el complejo RecA-CheW, permitiendo la identificación de las interfaces crúicas implicadas en la interacción entre ambas proteín.as y su papel en la forrn.ación de las matrices de señalización . Además, se han podido identificar como esenciales para la interacción los residuos Gln20,Arg222,Argl 76 y Lys250 de RecA,que se encuentran en.losdomin.ios esttucmrales N-terminal ycentral de dicha proteína,y los residuos Phe21,Lys55, Asp83 y Phe121 de CbeW,que por dónde se ubican no parecen interferir con ninguna otra región de unión descrita para ChcW. Además, los experimentos realizados demuestran que la pérdida de swarming es consecuencia de la disrupción de las matricesde seúalización generada por el aumemo en la concentración innacelular de la proteína RecA.Los ensayos llevados a cabo mediante microscopía de alta resolución, han permitido rasnear la distribución i nnacelular de las proteínas CheW y RecA durante la inducción de la respuesta SOS,y elucidar el papel de la proteína RecA en.la distribución de CheW y en el ensamblajedelasmatrices de sef1alización. Final meme, los resultados obre.nidos permiten proponer un modelo que explica cómo las células bacterianas adaptan su motilidad sobre superficies en respuesta a la presencia de agentes nocivos para el DNA mediante la detección de ésrns a través. de la induccióndel sis.tema SOS. Durantela coloniz.ación desuperficies,lascélulas bacterianas pueden estar expuestas a una amplia gama de compuestos dañinosy poten.dalm.ente letales. Sin embargo, las células pueden eludirlos gracias a la inducción de la respuesta SOS y la consiguiente inhibición del swarmíng. Así, cuando concentraciones sub-letales de compuestos tóxicosgeneran lesionesen el DNA,la proteína RecA se activa induciendo la respuesta SOS, y,dado que recA es uno de Los primeros genesen lajerarquía de la activación SOS,su concen.tración aumenta rápidamence.Éste incremento de la concentración intracelular RecA perturba el equilibrio entre esta proteína y CheW,concretamente,RecA secuestra a la proteína CheW, evitando el correcto ensamblaje de las matrices de seña!i:?ación polar, causando el cese del movimiento swarmingcuando seinduce la respuesta SOS.Mediante este mecanismo ,las bacterias evitan la exposición a concentraciones mayores del agente nocivo,y por lo tanto, la muerte celular. Una vez se reparan las lesiones en el DNA dañado, la concentración de RecA decrece hasta su nivel basal, evitando el secue5tro de la proteína CheW, re5taurándose así el ensamblaje de las matrices quimiosensoriales y también el movimiento en enjanbre.Así pues, los daros presentados han permitido la caracterización del mecanismo molecular que gobierna la modulación de swttrming mediada por RecA, mediante d cualSafmoneüapuede adaptar su motilidad en superficie en respuesta a condiciones ambientales adversas.We characterized the RecA-CheW protein complex, that allowed the identification of the critical interfaces implied in the interaction and its role in the signaling array assembly. RecA residues Gln20, Arg222, Arg176 and Lys250 that are located in the multi-functional N-terminal and central structural domains of the protein, were described as essential for the interaction. In the case of CheW protein, residues Phe21, Lys55, Asp83 and Phe121 were involved in the RecA-binding, that do not seem to interfere with any other CheW-biding targets. Further, the obtained results demonstrate that the loss of swarming ability when there is an increase of RecA concentration was the consequence of chemosensing array assembly disruption, that previous works have established as essential for swarming in temperate swarmers. Using high resolution microscopy assays we were able to track CheW and RecA protein distribution within the cell during SOS response induction, elucidating the role of the RecA protein in the distribution of CheW and the assembly of chemoreceptor signaling arrays. The obtained results head to the proposal of a model that explains how bacterial cells adapt their surface motility in response to the presence of DNA-damaging agents by sensing them via SOS system induction. During surface colonization, bacterial cells will likely be exposed to a wide range of injurious, and potentially lethal, compounds that are avoided through SOS response induction and consequent swarming ability impairment. When DNA injuries are generated, RecA activates the SOS machinery, and its concentration rises swi��ly since recA is one of the first genes to be induced in the hierarchy of SOS activation. The increase of intracellular RecA concentration during SOS-response disturbs the equilibrium between this protein and CheW, causing the cessation of swarming. RecA prompts the titration of CheW protein, preventing polar signaling array assembly during SOS response, and thereby inhibiting motility. By this mechanism, bacteria avoid exposure to higher concentrations of the DNA damaging agent, and so, cell death. Following DNA damage repair, RecA concentration returns to its basal level, releasing CheW, that restores chemosensory array assembly, returning the cell to a non-DNA damage motile condition. Therefore, the present work characterizes the molecular mechanisms that govern RecAmediated swarming modulation, by which using RecA as a sensor, Salmonella cells can adapt their surface motility in response to adverse environmental conditions