Nueva generación de biomarcadores epigenéticos y transcriptómicos en el cáncer de tiroides bien diferenciado

El cáncer de tiroides bien diferenciado (WDTC) es la neoplasia más común del sistema endocrino. Aunque es uno de los tumores con mejor pronóstico, con más del 90% de los pacientes alcanzando valores de supervivencia superiores a los 10 años, el tratamiento rutinario actual, la tiroidectomía total, es altamente agresivo. Esto ha llevado a la comunidad científico clínica replantearse la utilidad de los actuales sitemas de estratificación del riesgo. Si bien durante mucho tiempo se ha tratado de establecer el valor pronóstico de las diferentes alteraciones genéticas del WDTC (mutaciones en BRAF, RAS, PTEN, translocación RET/PTC, etc.) ninguna parece ser totalmente resolutiva. Al empezar esta tesis existían algunos trabajos en los que, a través del análisis del estado de metilación del DNA de genes específicos, se demostraba la implicación de la desregulación de esta marca epigenética en el desarrollo y progresión del WDTC. El objetivo general de esta tesis es la identificación de alteraciones de la metilación del DNA asociadas a características diagnósticas y/o pronosticas que nos permitan mejorar los sistemas actuales de estratificación del riesgo. Dado que la hipometilación global del genoma es una marca distintiva del cáncer que ha sido propuesta como biomarcador de diagnóstico, pronóstico y de respuesta al tratamiento en muchos tipos tumorales, nuestra primera aproximación consistió en el desarrollo de QUAlu (Quantification of Unmethylated Alu elements), una técnica simple, robusta, económica y fácilmente incorporable en los laboratorios de anatomía patológica que permite determinar la hipometilación global de muestras humanas de diversa naturaleza (tejido fresco, cortes histológicos, heces, biopsias líquidas y con aguja fina). Los resultados demuestran que la hipometilación del tejido tumoral es mucho más elevada y variable que la del tejido normal, que la hipometilación está asociada al tabaquismo y que el DNA extraído de heces y de biopsias líquidas de pacientes con cáncer de colon y cáncer de pulmón, respectivamente están más hipometilados que el de las personas sanas. Nuestra segunda aproximación consistió en el estudio de la metilación de los promotores génicos del WDTC mediante el array de metilación 27K de Illumina. De entre los resultados obtenidos, cabe destacar que los patrones de metilación del DNA del WDTC no sólo estaban asociados a los perfiles histopatológicos sino también a la mutación conductora subyacente (BRAF o RAS). Además, hemos podido realizar una selección de candidatos (DLEC1, COL4A2, KLK10) cuya validación ha sido llevada a cabo en una serie paralela confirmando los resultados del array. Por último, gracias a la integración de los datos de metilación del DNA con las características clínicas de los pacientes, hemos establecido el papel pronóstico de la metilación del promotor de los genes WT1 y EI24. Derivado del estudio de validación llevado a cabo con KLK10, encontramos la capacidad estratificadora del riesgo en WDTC de la familia génica de las calicreínas (KLKs). Las KLKs con un grupo de 15 proteasas de serina que agrupan juntas en el cromosoma 19. Gracias a su caracterización molecular y a la integración de estos datos con los rasgos clínicos de los pacientes obtenidos a través del TCGA (The Cancer Genome Atlas), hemos podido desarrollar un árbol de decisión, basado en las KLKs, capaz de clasificar los tumores de acuerdo a su perfil molecular, describiendo un subconjunto de tumores de buen pronóstico. En conclusión, en esta tesis hemos abierto el camino al estudio de una nueva serie de biomarcadores de nueva generación epigenéticos y transcriptómicos cuya puesta a punto en muestra prequirúrgicas puede representar un avance muy significativo en la medicina predictiva y personalizada del WDTC.The increasing incidence of papillary thyroid carcinoma (PTC) mainly due to improved diagnosis has led to an overtreatment of occult clinically irrelevant PTC. Conversely, the lack of prognostic markers often drives to an aggressive undertreatment (totally thyroidectomy). Hence, fine-tuning of thyroid cancer stratification would help to improve the management of the disease. The objective of this thesis is the characterization of molecular thyroid cancer fingerprints to identify (epi-)genetic alterations useful as diagnostic, prognostic and response to treatment biomarkers and/or therapeutic targets. Our first approach was to quantify global loss of DNA methylation in WDTC, since DNA hypomethylation is a landmark of most cancers, and therefore a good tumoral biomarker. With this purpose we developed Quantification of Unmethylated Alu repeats technique (QUAlu), a simple and robust method to determine global hypomethylation of human specimens that may be easily implemented in research and clinical settings. Our second approach was to interrogate the methylation status of gene promoters at the genome scale. We performed a 27K methylation array showing for the first time, that the epigenetic profiles were closely related to not only tumor histology but also to the underlying driver mutation. Derived of this work we identified a specific KLK10 hypomethylation in BRAF mutated and in a subset of wild type (WT) tumors. The molecular characterization of the KLK genes, a family of 15 serine proteases that cluster together in the chromosome 19, allowed as to develop a simple and robust KLK algorithm to stratify thyroid cancer risk, uncovering a novel good-prognosis subtype of tumors. In conclusion, in this thesis we have led the way in developing a new generation of epigenetic and transcriptomic biomarkers which setting up in preoperative samples would help to fine-tuning of thyroid cancer risk stratification