Toll-like receptors as modulators of intestinal barrier function

Las patologías funcionales (síndrome del intestino irritable, IBS) e inflamatorias gastrointestinales (enfermedad inflamatoria intestinal, IBD) se caracterizan por alteraciones de la función barrera epitelial, con un aumento de la permeabilidad, y cambios en la microbiota intestinal. Los receptores de tipo Toll (TLRs) participan en el reconocimiento bacteriano en el intestino y en el control neuroinmune local, estando, por tanto, implicados en la regulación de la función barrera del epitelio intestinal. El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar la implicación de los receptores TLR5 y TLR7 en la regulación de la función barrera epitelial del colon. Para ello se ha caracterizado la función barrera epitelial, tanto en condiciones in vitro (electrofisiología y permeabilidad a macromoléculas en un sistema de cámaras de Ussing), como in vivo (permeabilidad a macromoléculas), tras la sobre-estimulación local de los receptores TLR5 y TLR7 con agonistas selectivos, flagelina e imiquimod, respectivamente, en rata y ratón. Los efectos en la función barrera se han caracterizado en condiciones normales, en estados de permeabilización del epitelio con DMSO, y en condiciones de inflamación (colitis inducida por dextrano sulfato de sodio -DSS-). Con la finalidad de definir el mecanismo de acción, se ha valorado la dinámica de las uniones estrechas epiteliales (expresión génica de proteínas -RT-qPCR- y distribución celular -inmunohistoquímica-) y la activación inmune local (expresión de citoquinas pro-inflamatorias). Los resultados obtenidos muestran que la sobre-estimulación del TLR7 del colon in vivo mejora la función barrera epitelial en la rata en condiciones fisiológicas, observando una reducción dosis-dependiente de la permeabilidad epitelial a macromoléculas evaluada en las cámaras de Ussing. No obstante, en condiciones de permeabilización del epitelio con DMSO, la sobre-estimulación del TLR7 causa un empeoramiento de la función barrera valorada in vivo. En ratones, la sobre-estimulación del TLR7 cólico in vitro no tiene efecto. Sin embargo, en un modelo de colitis inducida por DSS, reduce el aumento de la permeabilidad epitelial causado por la inflamación. Por tanto, parecen existir diferencias especie-específicas en los efectos de la sobre-estimulación del TLR7 cólico, pudiéndose observar tanto acciones promotoras como lesivas de la función barrera epitelial. La sobre-estimulación del TLR5 cólico agrava la disfunción de la barrera asociada a la inflamación (colitis inducida por DSS) en el ratón, incrementando la permeabilidad a macromoléculas. Sin embargo, la adición del agonista del TLR5, flagelina, en las cámaras de Ussing no afecta a la función barrera epitelial, ni en condiciones fisiológicas, ni durante la inflamación. En ningún caso, estos efectos moduladores de la función barrera se asociaron a cambios en la expresión génica de las principales proteínas de las uniones estrechas (claudina-2, claudina-3, ocludina, tricelulina, molécula de adhesión de la unión de tipo 1 y Zonula Occludens 1) ni a su distribución celular (claudina-2, claudina-3 y ZO-1). De la misma forma, los factores moduladores de la barrera, quinasa de la cadena ligera de la miosina y pro-glucagón (precursor del péptido similar al glucagón de tipo 2), tampoco presentaron cambios en su expresión asociados a la sobre-estimulación del TLR5 o del TLR7. Finalmente, se observó un efecto inmunomodulador receptor-específico. La sobre-estimulación del TLR7 reveló efectos potencialmente protectores al reducir la expresión de la citoquina pro-inflamatoria IL12-p40. Por el contrario, la sobre-estimulación del TLR5 tendió a aumentar la expresión de marcadores pro-inflamatorios, sugiriendo, por tanto, efectos pro-lesivos. En conclusión, estos resultados muestran la importancia de las interacciones microbiota-hospedador mediadas por TLRs en el control de la función barrera epitelial intestinal. Tanto el TLR7 como el TLR5 cólicos pueden considerarse potenciales dianas terapéuticas para el control de la función barrera y las respuestas inmunes locales en desórdenes funcionales e inflamatorios gastrointestinales como el IBD y el IBS.Functional (irritable bowel syndrome, IBS) and inflammatory (inflammatory bowel disease, IBD) gastrointestinal disorders are characterized by an altered epithelial barrier function, with an increased permeability, and changes in the intestinal microbiota. Toll-Like Receptors (TLRs) participates in bacterial recognition within the intestine and in local neuro-immune control, thus participating in the regulation of intestinal epithelial barrier function. The objective of this work has been to characterize the implication of TLR5 and TLR7 in the regulation of colonic epithelial barrier function. For this, colonic epithelial barrier function has been studied in vitro (electrophysiology and permeability to macromolecules in a Ussing chamber system), as well as in in vivo conditions (permeability to macromolecules), after the local over-stimulation of TLR5 and TLR7 with selective agonists, flagellin and imiquimod, respectively, in rats and mice. The effects on barrier function have been studied in normal conditions, under states epithelial permeabilization with DMSO, and in conditions of inflammation -dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis-. In order to characterize the mechanisms of action, dynamics of tight junction (gene expression -RT-qPCR- and cellular distribution -immunohistochemistry- of tight junction proteins) and the presence of a local immune activation (gene expression of pro-inflammatory cytokines) were assessed. The results obtained indicate that the in vivo over-stimulation of colonic TLR7 improves epithelial barrier function in rats in physiological conditions, with a dose-dependent reduction in epithelial permeability to macromolecules, as assessed in Ussing chambers. However, under conditions of epithelial permeabilization with DMSO, the over-stimulation of TLR7 deteriorates barrier function, as assessed in vivo. In mice, the in vitro over-stimulation of colonic TLR7 was without effects. However, in a model of DSS-induced colitis, imiquimod reduces inflammation-induced increased epithelial permeability. Therefore, specie-specific differences seemed to exist for the barrier effects associated to the over-stimulation of colonic TLR7, leading to either protective or damaging actions on epithelial barrier function, depending upon the experimental conditions. The over-stimulation of colonic TLR5 aggravates the barrier dysfunction associated to inflammation (DSS-induced colitis) in mice, increasing the permeability to macromolecules. However, the direct addition of flagellin to the Ussing chambers did not affect epithelial barrier function, neither in physiologic conditions nor during inflammation. Regardless the conditions considered, TLR5/7-mediated modulatory actions on barrier function were not associated to changes in gene expression of the main tight junction-related proteins (claudin-2, claudin-3, occludin, tricellulin, junctional adhesion molecule 1 and Zonula Occludens 1). Moreover, no changes in the cellular distribution of tight junction proteins (claudin-2, claudin-3 y ZO-1) was observed. Likewise, TLR5/7 over-stimulation was not associated to changes in the expression of the barrier-modulating factors myosin light chain kinase and proglucagon (precursor of glucagon-like peptide 2). Finally, TLR-specific immunomodulatory effects were also observed. Over-stimulation of TLR7 revealed potential protective effects, reducing the expression of the pro-inflammatory cytokine IL12-p40. In contrast, over-stimulation of TLR5 tended to increase the expression of pro-inflammatory markers, thus suggesting pro-damaging effects. In conclusion, these results provide evidence of the importance of TLRs-dependent host-microbial interactions in the control of intestinal epithelial barrier function. Colonic TLR5 and TLR7 should be considered potential therapeutic targets for the control of barrier function and local immune responses in functional and gastrointestinal disorders, such as IBD and IBS