Theoretical study on the mechanism of the reaction catalyzed by protein kinase

Malgrat el gran nombre d’estudis experimentals i computacionals sobre l’estructura i funció de les proteïnes quinases, els detalls exactes dels canvis estructurals i mecanístics dels passos individuals de la reacció catalítica de transferència del grup fosforil romanen incerts. En principi, els estudis computacionals poden subministrar informació minuciosa i una coneixença complementària al treball experimental, però aquest objectiu només es pot assolir si es fan servir els mètodes computacionals adequats i si el model teòric que s’utilitza representa correctament el sistema biològic. En aquesta Tesi, el mètode QM/MM a nivell DFT/MM s’ha utilitzat per a descriure els diferents mecanismes de reacció sobre la hipersuperfície d’energia potencial de la reacció global de transferència del grup fosforil catalitzada per la Proteïna Quinasa A (PKA). Cal destacar, que a més d’utilitzar models complets i solvatats del sistema biomolecular i nivells de teoria més alts que en treballs anteriors, s’han fet servir també diferents tècniques i algoritmes inclosos en el codi ChemShell, a fi de millorar els càlculs dels camins de reacció i les optimitzacions d’estats estacionaris. En particular, coordenades de reacció més flexibles i el mètode microiteratiu per a localitzar estructures d’estats de transició ens han permès aplicar una metodologia multiescala consistent i fiable per a analitzar minuciosament tant el mecanisme associatiu (que implica la transferència de fosforil simultàniament amb la protonació del grup fosfat transferit) com el dissociatiu (que implica dues etapes: la transferència de fosforil i la protonació del substrat fosforilat) de la reacció de transferència de fosforil catalitzada per la PKA. S’ha prestat especial atenció a les funcions específiques dels residus Asp166, Lys168 i Thr201, al Gly-rich loop, als ions metàl·lics, i a la conformació i l’estat de protonació al llarg de la reacció química de la cadena lateral del substrat i del fosfat que es transfereix. Els resultats d’aquesta Tesi han demostrat que la reacció catalitzada per la PKA no depèn del substrat i que el mecanisme dissociatiu és clarament favorable respecte el mecanisme associatiu. No obstant, els càlculs presentats també mostren que el mecanisme associatiu seria viable quan el dissociatiu està impedit, com amb el mutant D166A. Aquest punt reobre un debat sobre la viabilitat del mecanisme associatiu que semblava superat donat els darrers estudis teòrics. A més a més, els camins de reacció per a la retro-protonació del substrat fosforilat per part del residu Asp166 s’han localitzat, demostrant que Asp166 es comporta com un catalitzador àcid/base general al llarg del mecanisme dissociatiu. Per altra banda, els perfils d’energia potencial QM/MM calculats també demostren, per primera vegada, que la reacció catalítica de transferència de fosforil és viable amb ions metàl·lics alcalinoterris diferents del Mg2+, confirmant resultats experimentals recents que proposen el paper fisiològic del Ca2+ a l’activitat de les quinases. Tant pel mecanisme associatiu com pel dissociatiu, la localització precisa i l’orientació de la triada Asp166-Lys168-Thr201 i de la xarxa de ponts d’hidrogen que aquests residus estableixen al centre actiu, s’ha vist que són essencials per a la catàlisi i especialment per a l’estabilització de les estructures dels estats de transició involucrats. Finalment, els resultats d’aquesta Tesi han proveït amb una seqüència completa de l’evolució geomètrica de l’estructura del complex ternari al llarg de la reacció catalítica. Això permet una comparació acurada amb les estructures de raigs-X cristal·logràfiques que han estat proposades experimentalment com a imatges moleculars del procés catalític de fosforilació. En particular, el bon acord entre les estructures teòriques i els estudis experimentals validen la visió atòmica de la reacció presentada en aquesta Tesi, revelant canvis conformacionals, de coordinació i dels ponts d’hidrogen que tenen lloc durant la recció química i la seva relació amb la dinàmica de l’enzim.Despite extensive experimental and computational studies about the structure and function of kinases, exact details regarding the complex structural changes and the mechanistic details of individual stages involved in the catalyzed phosphoryl-transfer reaction remain uncertain. In principle, computational studies can provide detailed information and insights to complement experimental studies, but this goal can only be attained when the appropriate computational approaches are employed and the theoretical model used is a good mimic of the biological system. In this Thesis, the QM/MM approach at the DFT/MM level of theory was used to describe the different reaction mechanisms on the potential energy hypersurface of the global phosphoryl-transfer reaction catalyzed by the Protein Kinase A (PKA). Remarkably, besides making use of more complete solvated models of the biomolecular system and higher levels of theory than the ones employed in previous works, several techniques and algorithms within the computational chemistry suite ChemShell were used to improve the accuracy of the reaction path calculations and stationary points optimizations. In particular, more flexible reaction coordinates, the location of the stationary points with the hybrid delocalized internal coordinates, and the microiterative method to locate transition structures allowed us to apply a consistent and reliable multiscale methodology to examine minutely both the associative (involving a concomitant phosphoryl-transfer and protonation of transferred phosphate) and dissociative (involving two steps: phosphoryl-transfer and back protonation of the phosphorylated substrate) mechanisms of the phosphoryl-transfer reaction catalyzed by PKA. Special attention was paid in the specific roles of the invariant residues Asp166, Lys168, and Thr201, the conserved Gly-rich loop, the metal ions, and the conformation and protonation state of the substrate residue side chain and transferred phosphate along the chemical reaction. The results in this Thesis demonstrate that the catalytic reaction catalyzed by PKA is not substrate-dependent and that the dissociative mechanism is clearly more favorable than the associative one. Nevertheless, the presented calculations also show the plausibility of the associative reaction pathway when the dissociative counterpart is impeded as it is in the D166A mutant. This reopens the debate about the plausibility of the associative reaction pathway that in view of the last theoretical works in the field seemed to be overcame. Moreover, the reaction paths for the back protonation of the phosphorylated substrate by Asp166 have been located, so demonstrating that Asp166 behaves as a general acid/base catalyst along the dissociative mechanism. In addition, QM/MM potential energy profiles determined in this Thesis also demonstrate, for the first time, that the catalyzed phosphoryl-transfer is plausible with alkali earth metal ions other than Mg2+ ions, what confirms recent experimental results where the physiological role of Ca2+ in kinase activity has been proposed. For both the associative and the dissociative mechanisms, the precise location and orientation of the triad Asp166-Lys168-Thr201 and the hydrogen bond network these residues establish within the active site are shown to be essential for catalysis, particularly in the stabilization of the transition state structures involved. Lastly, the results in this Thesis provide a complete sequence of the geometrical evolution of the structure of the ternary complex along the catalytic reaction. This permits an accurate comparison with new X-ray crystallographic structures that have been suggested as experimental snapshots of the catalyzed-phosphorylation process In particular, the good agreement between the theoretically determined structures and the crystallographic studies validate the atomic view of the reaction presented in this Thesis, thus revealing conformational, coordination, and hydrogen bond changes that occur during the chemical step and its relation with the enzyme dynamics