Validación preclínica del receptor EP2 mastocitario como diana terapéutica antiasmática

El asma es una enfermedad crónica de las vías respiratorias cuyo abordaje terapéutico actual no frena su progresión, y en ocasiones no revierte la sintomatología. El análisis de mecanismos endógenos de protección puede resultar en la identificación de nuevas dianas farmacológicas efectivas. Los estudios preclínicos realizados hasta ahora en nuestro laboratorio junto con evidencia clínica y básica de otros grupos, sugirieron la hipótesis de que la activación selectiva del receptor prostanoide EP2 de le la PGE2 inhibe la actividad mastocitaria, y consecuentemente reduce el proceso patológico respiratorio inducido en ratones por exposición a aeroalérgenos, lo cual puede suponer una estrategia terapéutica antiasmática sinérgica a la del bloqueo mastocitario por otros mecanismos. Con el fin de verificarla, se planteó el primer objetivo: evaluar la función selectiva del receptor prostanoide EP2 en la modulación de la actividad mastocitaria, y en la reactividad respiratoria a aeroalérgenos. Se observó en poblaciones mastocitarias fenotípicamente diversas la inhibición de los mastocitos mediante dos agonistas EP2 químicamente distintos. Inhibición que también se demostró in vivo en un modelo de asma en ratón expuesto a aeroalérgenos de ácaros del polvo. El efecto inhibitorio sobre los mastocitos se acompañó de la prevención de la hiperreactividad bronquial, y apuntaba hacia un posible control del proceso inflamatorio broncovascular. La naturaleza protectora del agonismo EP2 se confirmó al administrar antagonistas en modelos in vitro e in vivo. Estos desencadenaron una sobreactividad de los mastocitos que agravó la alteración respiratoria. Todo ello sugiere que el efecto beneficioso de la PGE2 descrito en estudios clínicos experimentales, es consecuencia de la mediación del receptor EP2 mastocitario. El segundo objetivo planteado fue el desarrollo de un ratón transgénico que sobreexpresase el receptor EP2 específicamente en los mastocitos con el fin de disponer de una herramienta experimental para evaluar la relevancia relativa del receptor EP2 en la protección inducida por PGE2. Se logró con éxito insertar el gen de EP2 y sobreexpresarlo, demostrándose en algunos ensayos in vitro que los mastocitos aislados de los ratones transgénicos EP2 respondían con un incremento en el bloqueo. Sin embargo no se pudo confirmar in vivo el efecto beneficioso atribuible a la presencia de un mayor número de receptores EP2, probablemente debido a las fluctuaciones compensatorias en la expresión de otros genes relacionados. El desarrollo de la colonia transgénica de EP2 requiere de una caracterización más exhaustiva para investigar la importancia del EP2 mastocitario en la prevención de la alteración respiratoria. Finalmente, en un tercer objetivo se planteó evaluar comparativamente la efectividad preclínica de la inhibición mastocitaria mediante agonismo EP2 y bloqueo de la IgE con anticuerpos monoclonales, en modelos de alergia in vivo e in vitro. Se demostró en un modelo de anafilaxia cutánea in vivo y en poblaciones mastocitarias in vitro que el agonismo EP2 y la neutralización de la IgE ejercen un bloqueo de los mastocitos cuantitativamente equiparable. Para posteriores estudios de la potencial sinergia o complementariedad terapéutica entre ambos mecanismos en las vías respiratorias de ratones sensibilizados, se desarrolló con éxito un innovador modelo de anafilaxia respiratoria pasiva (PRA) en ratones transgénicos que expresaban el receptor humano de la IgE. Los resultados obtenidos en esta tesis permiten concluir que la activación del eje “PGE2 - EP2 mastocitario – asma” supone un mecanismo endógeno de protección frente a la disfunción de las vías respiratorias inducida por aeroalérgenos. Los nuevos modelos experimentales in vivo desarrollados en este proyecto permitirán caracterizar el mecanismo antiasmático, y confirmar la condición de diana terapéutica del receptor EP2, o de otras moléculas que formen parte de ese eje.Asthma is a chronic disease of the airways whose therapeutic approach does stop progression, and occasionally does not revert the symptoms. Studying endogenous protective mechanisms may lead to the identification of newly effective pharmacological targets. Preclinical studies carried out in our laboratory together with clinical and basic evidence from other groups, suggested the following hypothesis: selective activation of the EP2 prostanoid receptor of PGE2 inhibits mast cell activity, and consequently reduces the pathological respiratory process induced in mice exposed to aeroallergens, and this may arise as an antiasthmatic therapeutic strategy synergic to mast cell blockade through other mechanisms. In order to check it, the first objective was to assess the selective function of the EP2 prostanoid receptor as a mast cell activity and aeroallergen-induced airways reactivity modulator. Phenotypically distinct mast cell populations were shown to be inhibited by means of chemically different agonists. Such inhibition was also seen in vivo in the asthma murine model induced through exposure to house dust mite aeroallergens. Mast cells inhibition was paralleled by a prevention of the airway hyperreactivity, and possibly a control of the bronchovascular inflammatory process. The protective nature of EP2 agonism was confirmed through the administration of antagonists in in vitro and in vivo models, where mast cells hyperreleasability and worsening of airways disorder were observed. All in all, this suggested that the described benefit of PGE2 in clinical experimental settings is mediated by the mast cells EP2 receptor. The second objective was to develop a transgenic mouse overexpressing the EP2 receptor specifically on the mast cells surface as an experimental tool to evaluate the relative relevance of EP2 in PGE2-driven protection. The EP2 gene was successfully inserted and overexpressed, owing to an increased blockade of the activity of mast cells isolated from transgenic mice. However, the beneficial effect attributable to a higher number of EP2 receptors could not be seen in vivo, possibly due to the compensatory fluctuation of related genes. The developed EP2 transgenic mice require a further characterization in order to investigate the role of mast cell EP2 in prevention of the respiratory dysfunction. Finally, the third objective was to compare the preclinical effectiveness of EP2 agonism versus anti-IgE using monoclonal antibodies, in allergy models in vivo and in vitro. Both, EP2 agonism and IgE neutralization exerted a quantitatively similar effect on mast cells population in vitro and in a model of cutaneous anaphylaxis in vivo. In order to further study the synergy or therapeutic complementarity between both mechanisms, an innovative model of passive respiratory anaphylaxis (PRA) was successfully established in transgenic mice expressing the human IgE receptor. The results of this thesis brought us to conclude that the “PGE2- mast cell EP2-asthma” axis is an endogenous protective mechanism against the airway dysfunction caused by aeroallergens. The new in vivo experimental models developed in this project, will allow to characterize the antiasthmatic mechanism, and confirm the EP2, or other molecules along the axis, as therapeutic targets