Structural and functional characterization of regulatory metallocarboxypeptidases: Studies on human carboxypeptidases D and Z, and the transthyretin-like domain

Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino ácidos del extremo C terminal en proteínas y péptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreática que hidroliza residuos C terminales hidrofóbicos. En las décadas siguientes después del descubrimiento de la CPA1, docenas de MCPs adicionales han sido descritas en diferentes tejidos y fluidos extrapancreaticos, comprendiendo un amplio rango de funciones fisiológicas que van desde la digestión de los alimentos hasta la producción de neuropéptidos y hormonas peptídicas o el procesamiento selectivo de la tubulina. La presente tesis tiene como objeto profundizar en el conocimiento de la estructura y función biológica de dos MCPs reguladoras. Para este propósito, se aplicaron un amplio espectro de aproximaciones bioquímicas con el fin de elucidar la actividad biológica de las carboxipeptidasas D y Z humanas. Además, se decidió estudiar por primera vez la estructura y funciones de los dominios tipo transtiretina (TTL) que se encuentran en todos los miembros de esta subfamilia de proteasas, escogiéndose como ejemplo el primer dominio TTL perteneciente al primer dominio catalítico de la carboxipeptidasa D humana (denominada en este trabajo como h-TTL). En el primer capítulo se describe la formación de estructuras amiloides bajo condiciones fisiológicas por el dominio h-TTL, y se descubre que el motivo de plegamiento transtiretina monomérico tiene una propensión inherente a agregar, dada la presencia de elementos estructurales amiloidogénicos preformados. El mecanismo de agregación que se describe en este trabajo para una proteína nativa monomérica tipo transtiretina, también se ha encontrado en diversas proteínas globulares, inicialmente solubles y asociadas con enfermedades conformacionales que se generan por la deposición de agregados, pudiendo ser un hecho genérico para motivos de plegamiento que muestren elementos amiloidogenicos preformados en sus estructuras, esencialmente hojas β. El segundo capítulo muestra la estructura cristalográfica resuelta a súper alta resolución de la h-TTL descrita en el primer capítulo. La información derivada del presente estudio podría facilitar el conocimiento del papel biológico de los dominios TTL encontrados en todos los miembros de la subfamilia M14B, pudiendo ser utilizada como una herramienta interesante para analizar en detalle las propiedades estructurales y los mecanismos de plegamiento de estos dominios. El tercer capítulo comprende la caracterización de la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa D humana, utilizando una combinación de diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas. Esta enzima única con múltiples centros catalíticos, podría estar implicada en el procesamiento de neuropéptidos y factores de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de su mecanismo de acción es de especial relevancia para el campo de la biomedicina. En el cuarto capítulo se describe el desarrollo de un método simple y barato para mejorar la producción proteica de carboxipeptidasas que presentan afinidad por heparina usando células de mamífero, cogiendo como ejemplo el caso de la carboxipeptidasa Z. La proteína purificada mediante este sistema es enzimáticamente activa y puede ser utilizada para estudios estructurales y funcionales de alto rendimiento. En el último capítulo se utilizan diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas para caracterizar la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa Z humana. Además, en este trabajo se presenta el modelado de su dominio catalítico, así como el de su dominio tipo frizzled, con el fin de analizar su papel en la vía señalización de Wnt.Metallocarboxypeptidases (MCPs) are zinc-dependent enzymes that cleave single amino acids from the C termini of proteins and peptides. The first MCP to be identified was carboxypeptidase A1 (CPA1), a pancreatic enzyme that removes C-terminal hydrophobic residues. In the ensuing decades since the discovery of CPA1, dozens of additional MCPs have been found in different extra-pancreatic tissues and fluids, comprising a wide range of physiological roles ranging from digestion of food to the production of neuropeptides and peptide hormones and the selective processing of tubulin. The present thesis has the aim to gain insights into the knowledge of the structure and biological functions of two regulatory MCPs. For this purpose, we applied a wide range of biochemical approaches to elucidate biological activities of human carboxypeptidases D and Z. Furthermore, we decided to study for the first time the structure and roles of the transthyretin-like (TTL) domains found in all members of this subfamily of proteases, taking as example the first TTL domain belonging to the first catalytic domain of human carboxypeptidase D (termed here as h-TTL). The first chapter describes the amyloid formation under physiological conditions by h-TTL and unravels that the monomeric transthyretin fold has an inherent propensity to aggregate due to the presence of preformed amyloidogenic structural elements. The aggregation mechanism described in this work for a natively monomeric transthyretin-like protein, is being found also in a number of initially soluble globular proteins associated with protein deposition diseases and might be in fact quite generic for folds displaying preformed amyloidogenic elements in their structures, essentially β-sheets. The second chapter presents the crystal structure solved at ultra-high resolution of the h-TTL described in the first chapter. The information derived in the present study might facilitate the understanding of the biological roles of the TTL domains found in M14B subfamily members and would be an interesting tool to analyze in detail the structural properties and the folding mechanisms of these domains. The third chapter comprises the characterization of the substrate specificity of human carboxypeptidase D by using a combination of quantitative peptidomic approaches. This unique enzyme with multiple catalytic sites might be implicated in the processing of neuropeptides and growth factors. Thereby, the study of its mechanism of action is of significant importance for biomedicine. The fourth chapter describes de development of a simple and inexpensive method to improve protein production of heparin-affinity carboxypeptidases using mammalian cells, taking as example the case of carboxypeptidase Z. The purified protein is enzymatically active and can be used for high-throughput functional and structural studies. The fifth chapter applies several quantitative peptidomic approaches to characterize the substrate specificity of the human carboxypeptidase Z. Furthermore, this work provides the modelling of its catalytic domain, as well as of their frizzled-like domain, in order to analyze their role in Wnt signaling