Role of microRNAs in plant innate immunity

Los pequeños ARNs son ARNs cortos no codificantes que regulan la expresión génica en la mayoría de eucariotas. Las plantas tienen dos clases de pequeños ARNs, los microARNs (miRNAs) y los pequeños ARNs de interferencia (siRNAs), que se diferencian por su biogénesis y su modo de acción. Actualmente se estima que las pérdidas debidas a patógenos y plagas alcanzan el 50-80%, siendo uno de los factores limitantes de la producción y causando graves pérdidas económicas. Tenemos pues la necesidad de mejorar el conocimiento de los mecanismos de defensa y desarrollar nuevas estrategias para la protección de los cultivos. Con el fin de ampliar los conocimiento en este sector, se han llevado a cabo estudios con Arabidopsis y arroz, los dos sistemas modelo usados en genómica funcional en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. En el primer capítulo, se analizaron las alteraciones en la acumulación de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, en respuesta al tratamiento con elicitores en plantas de Arabidopsis. Entre los miRNAs regulados por elicitores se encuentra miR168, que regula ARGONAUTE1, el componente principal del complejo RISC (RNA-induced silencing complex) de la maquinaria de funcionamiento de miRNAs. Los microarrays permitieron, además de analizar miRNAs conocidos, la identificación de un pequeño ARN incorrectamente anotado como miRNA en el registro miRBase. Se demostró que este pequeño ARN es un pequeño ARN heterocromático (hc-siRNA) denominado siRNA415. En el segundo capítulo, se usaron librerías de secuenciación masiva de pequeños ARNs para la identificación global de miRNAs de arroz regulados por elicitores fúngicos. Esto permitió también describir 9 miRNAs no caracterizados previamente. Combinando dichas librerías con el análisis de nuestros degradomas, se identificaron sus respectivos targets y se observó la existencia de redes reguladoras enriquecidas en miRNAs regulados por elicitores. Específicamente, se identificó un número importante de miRNAs y sus genes diana, implicados en las rutas de biosíntesis de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, hc-siRNAs y “trans-acting siRNAs” (ta-siRNAs). Así mismo se presentan evidencias de miRNAs y sus genes diana implicados en la señalización mediada por hormonas así como en la interacción entre rutas hormonales, demostrando así un gran potencial en la regulación de la inmunidad del arroz. Asimismo se describe la regulación de genes de arroz que contienen “Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame” (CPuORF) mediada por miRNAs. Esto sugiere la existencia de una red reguladora nueva que integra la función de miRNAs y CPuORF en plantas. El conocimiento adquirido en este estudio ayudará al la comprensión de los mecanismos de defensa mediados por miRNAs, así como a desarrollar estrategias apropiadas a la protección del arroz. En el tercer capítulo, se uso la combinación de herramientas bioinformáticas y experimentales para el análisis de miRNAs policistrónicos en arroz, observando la existencia de 23 loci con la habilidad de formar la típica estructura de horquilla de los precursores de miRNAs. Se presentan evidencias experimentales de 7 miRNAs policistrónicos que contienen tanto miRNAs homólogos como miRNAs no homólogos. Se demostró también un patrón de conservación en diferentes especies de arroz (Oryza sativa) cuyo genoma es AA, no presente en especies primitivas de arroz. Conjuntamente, los resultados obtenidos en este trabajo apoyan la idea que los miRNAs pueden ser considerados como componentes de la respuesta de las plantas a la infección por patógenos, posiblemente actuando como nodos de regulación de diferentes procesos fisiológicos durante la adaptación de las plantas a la infección.Small RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs that guide gene silencing in most eukaryotes. Plants have two main classes of sRNAs, microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs), which are distinguished by their mode of biogenesis and mechanisms of action. In this day and age, crop losses due to pathogens and pests are estimated from 50% to 80%, factors limiting crop production and causing important economical losses. There is then an imperative need to improve our knowledge in defense mechanisms and to develop novel strategies for crop protection. To improve the understanding in this field, we carried out studies in Arabidopsis and rice plants, the two model systems used for functional genomic studies in dicot and monocot plant species. In the first chapter, we analyzed alterations on the accumulation of smRNAs in response to elicitor treatment, including miRNAs, in Arabidopsis plants. Among the elicitor-regulated miRNAs was miR168 which regulates ARGONAUTE1, the core component of the RNA-induced silencing complex involved in miRNA functioning. In addition to known miRNAs, microarray analysis allowed the identification of an elicitor-inducible small RNA that was incorrectly annotated as a miRNA in the miRBase registry. We demonstrated that this smRNA, is a heterochromatic-siRNA (hc-siRNA) named as siRNA415. In the second chapter, we used deep sequencing of small RNA libraries for global identification of rice miRNAs that are regulated by fungal elicitors. We also describe 9 previously uncharacterized miRNAs. Combined small RNA and degradome analyses revealed regulatory networks enriched in elicitor-regulated miRNAs supported by the identification of their corresponding target genes. Specifically, we identified an important number of miRNA/target gene pairs involved in small RNA pathways, including miRNA, heterochromatic and trans-acting siRNA pathways. We present evidence for miRNA/target gene pairs implicated in hormone signaling and cross-talk among hormone pathways having great potential in regulating rice immunity. Furthermore, we describe miRNA-mediated regulation of Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame (CPuORF)-containing genes in rice, which suggests the existence of a novel regulatory network that integrates miRNA and CPuORF functions in plants. The knowledge gained in this study will help in understanding the underlying regulatory mechanisms of miRNAs in rice immunity and develop appropriate strategies for rice protection. In the third chapter, we used a combination of bioinformatic tools and experimental analyses for the discovery of new polycistronic miRNAs in rice, revealing 23 loci with the ability to form the typical hairpin structure of miRNA precursors in which two or more mature miRNAs mapped along the same structure. Evidence is presented on the polycistronic nature of 7 miRNA precursors containing homologous or non-homologous miRNA species. We also demonstrated a pattern of conservation in the genome of rice (Oryza sativa) species that have an AA genome, but not in primitive rice species. Collectivelly, results obtained in this work support the notion that miRNAs might be considered as components of the plant response to pathogen infection, possible acting as regulatory nodes of different physiological processes during plant adaptation to infection conditions