Caracterización del mutante nfxB de Pseudomonas aeruginosa: papel en la resistencia antibiótica de los biofilms e interacción con los mecanismos de resistencia intrínsecos.

La azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por P. aeruginosa. No presenta actividad bactericida frente a este microorganismo en cultivo planctónico, pero se sabe que este macrólido inhibe la formación de biofilms gracias a su capacidad para interferir en el sistema quorum sensing bacteriano. En las infecciones crónicas frecuentemente se seleccionan mutantes que presentan un alto grado de adaptación al nicho ecológico y a los antimicrobianos, como ocurre con el mutante en nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ. Este fenotipo es frecuentemente aislado en pacientes con fibrosis quística, EPOC y bronquiectasias, y se caracteriza por presentar resistencia a los antimicrobianos que puedan actuar como sustrato y por presentar una marcada hipersensibilidad a antibióticos betalactámicos no sustratos de la bomba y aminoglucósidos. Uno de los objetivos del presente trabajo fue averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en crecimiento planctónico como en forma de biofilm. Se evaluó el impacto de la hiperproducción de alginato y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También fue objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ, la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM. Para llevar a cabo tales objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gen mucA, mutS y la combinación de ambos y se evaluó su comportamiento en forma de biofilm al ser tratado con diversas concentraciones de azitromicina durante varios días. Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinó su perfil de sensibilidad, se cuantificó la expresión relativa de mexD mediante PCR a tiempo real y finalmente se secuenció su gen regulador nfxB revelando diversas mutaciones inactivantes. En síntesis, los resultados obtenidos demuestran que durante el tratamiento de los biofilms con azitromicina existe una selección de mutantes nfxB en las cepas salvajes, hiperproductoras de alginato y particularmente en las cepas hipermutadoras. Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se evaluaron sus propiedades biológicas, su sensibilidad al complemento del suero humano, la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó su transcriptoma, mostrando que aparentemente no se sobrexpresan genes implicados en la resistencia antimicrobiana, a excepción de los pertenecientes al sistema mexCD-oprJ. Aunque en el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se hallaron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem. De igual forma, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. Sin embargo, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenadante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB reveló un drástico descenso de la actividad periplasmática, a expensas de un aumento de la actividad determinada en el sobrenadante. Nuestros datos revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos es debida a la incapacidad para mantener AmpC en el espacio periplásmico, produciéndose una permeabilización al medio extracelular. No obstante un análisis más profundo de este fenómeno nos ha permitido demostrar cómo dicha permeabilización resulta beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con betalactámicos, ya que AmpC quedaría recluido en su matriz. Finalmente, los datos preliminares sugieren que la permeabilización que experimenta AmpC en el mutante nfxB ocurre también para otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D. Azithromycin has shown promising results in the treatment of P. aeruginosa chronic respiratory infections during the last years. Although it does not show bactericidal activity against planktonic cells, this macrolide is known to inhibit biofilm formation due to its ability to block or interfere with the bacterial quorum sensing. During chronic infections, mutants showing high level of adaptation to the lung environment and antibiotics are often selected, such as mutants in the gene nfxB, which encodes the negative regulator of the efflux pump MexCD-OprJ. This phenotype is frequently isolated in the respiratory tract of Cystic Fibrosis patients, but also in COPD and bronchiectasis, and it is characterized by showing antimicrobial resistance to those antimicrobials that can act as a substrate, and for presenting a marked hypersusceptibility to nonsubstrate beta-lactams and aminoglycosides. Therefore, one of the aims of this work was to assess if these nfxB mutants are selected during prolonged exposure to azithromycin in both planktonic and biofilm growth. Furthermore, we evaluated the effect of alginate overproduction and hypermutation on the bactericidal activity and the dynamics of development of resistance to azithromycin. In this work we have also characterized the nfxB mutant as well as the relationship between MexCD-OprJ overexpression (driven by nfxB inactivation), the activity of the chromosomal beta-lactamase AmpC and the major efflux pumps MexAB-OprM and MexXY-OprM. To carry out these objectives, strains PAO1, its mucA mutant, and their respective mutS-deficient hypermutable derivatives were constructed. The biofilms formed by these strains were treated with different azithromycin concentrations for several days and the dynamics of antibiotic resistance development was evaluated. Azithromycin resistant mutants were characterized, their susceptibility profiles were determined, their relative mexD expression was quantified and finally its regulatory gene nfxB was sequenced, revealing several inactivating mutations. In summary, our results demonstrate that nfxB mutants are readily selected during azithromycin treatment of biofilms in wild-type strains, alginate hyperproducers and particularly in hypermutable strains. Then, the knockout nfxB mutant was constructed and its biological features characterized, the susceptibility to the complement of human serum, its rifampicin resistance mutation rate and finally its whole genome gene expression was analyzed, showing that apparently there are no other overexpressed genes involved in antimicrobial resistance except for those belonging to MexCD-OprJ operon. Although no differences in the penicillin binding protein profile between the nfxB mutant and the reference strain were found, analysis of the outer membrane protein profile revealed a reduced expression of OprM, which is responsible for the hypersensitivity to aminoglycosides and beta-lactams, except imipenem. Likewise, a decrease in the OprM expression did not explain the reversion of the high beta-lactam resistance phenotype in the nfxB-dacB double mutant. However, beta-lactamase activity determination in different cell fractions (crude extract, periplasm, and supernatant) of nfxB and nfxB-dacB mutants revealed a dramatically decreased periplasmic beta-lactamase activity in contrast with an increased activity in supernatant. Then we assessed whether this difference was beneficial in a beta-lactam treated biofilm, showing that in this scenario the nfxB mutant yield higher survival rates than their respective parent strains in both induced and constitutively overexpressed AmpC conditions. Therefore, our data show that hypersusceptibility to beta-lactams is due to a deficient AmpC accumulation in the periplasmic space, resulting in a leakage out of the cell. However a deeper analysis has allowed us to demonstrate how that leakage was protective in biofilm growth, where AmpC could be confined in the extracellular matrix. Finally, preliminary data suggest that the AmpC leakage observed in the nfxB mutant also occurs with other beta-lactamases, particularly in B and D classes. L’azitromicina ha mostrat resultats prometedors en el tractament de la infecció respiratòria crònica per Pseudomones aeruginosa. No presenta activitat bactericida davant aquest microorganisme en cultiu planctònic, però es sap que aquest macròlid la formació de biofilms gràcies a la seva capacitat per interferir en el sistema quòrum sensing bacterià. En el transcurs de les infeccions cròniques sovint es seleccionen mutants que presenten un grau d’adaptació al nínxol ecològic i als antibiòtics, tal com escau amb el mutant nfxB, gen regulador negatiu de la bomba d’expulsió activa MexCD-OprJ. Aquest fenotip freqüentment és aïllat en mostres respiratòries de pacients amb fibrosi quística, MPOC i bronquièctasis, i es caracteritza per presentar resistència als antibiòtics que poden actuar com a substrat i per presentar una marcada hipersensibilitat als antibiòtics betalactàmics no substrats de la bomba i aminoglucòsids. Un dels principals objectius d’aquest treball va esser esbrinar si durant l’exposició perllongada a azitromicina es seleccionen mutants nfxB tant en cultiu planctònic com en forma de biofilm. Es va avaluar l’impacte de la hiperproducció d’alginat i l’efecte de la hipermutació sobre l’efecte bactericida, sobre la dinàmica de desenvolupament de resistències a azitromicina. També va esser objecte d’estudi la caracterització del mutant nfxB, així com la relació entre la hiperexpresió de MexCD-OprJ (a través de la mutació al seu gen regulador nfxB), la activitat de la cefalosporinasa cromosòmica AmpC, i les bombes d’expulsió intrínseques MexAB-OprM i MexXY-OprM. Per a dur a terme aquests objectius es van construir mutants deficients en el gen mucA, mutS) i la combinació de ambdós. Seguidament s’avaluà el comportament del mutants en dins un biofilm tractat amb diferents concentracions de azitromicina, així com la dinàmica de desenvolupament de resistències durant varis dies. Es caracteritzaren els mutants resistents a azitromicina, es va determinar el seu perfil de sensibilitat, es quantificà l’expressió relativa de mexD i finalment es va seqüenciar el seu gen regulador nfxB revelant diverses mutacions inactivants. En resum, els resultats obtinguts ens han permès demostrar que durant el tractament de biofilms amb azitromicina existeix una selecció de mutants nfxB a les soques salvatges, les hiperproductores d’alginat i particularment a les soques hipermutadores. Seguidament es va construir el mutant nul nfxB i es va procedir a l’avaluació de les seves propietats biològiques, la seva sensibilitat al complement del sèrum humà i la tassa i freqüència de mutació en rifampicina. Finalment es va analitzar el seu transcriptoma, mostrant que aparentment no es sobreexpressen gens implicats en la residència antibiòtica, exceptuant aquells que pertanyen a l’operó mexCD-oprJ. Al perfil de proteïnes fixadores de penicil•lina no es trobaren diferencies entre el mutant nfxB i la soca de referència, però l’anàlisi de proteïnes de membrana externa va revelar una disminució de la expressió de OprM, responsable de la hipersensibilitat a aminoglucòsids i betalactàmics amb l’excepció de l’imipenem. De forma anàloga, la disminució de l’expressió de OprM no justificà la reversió del fenotip de resistència a betalactàmics en el mutant nfxB-dacB. No obstant, la determinació fraccionada (extracte cru, periplasma i sobrenedant) de l’activitat betalactamasa específica del mutant nfxB i del mutant doble nfxB-dacB mostrà un dràstic descens de l’activitat periplasmática com a conseqüència de la inactivació de nfxB, a costa d’un augment de l’activitat mesurada al sobrenedant. Així, les nostres dades revelen que la hipersensibilitat a betalactámics és deguda a la incapacitat per acumular AmpC a l’espai periplàsmic, produint-se una permeabilització cap al medi extracel•lular. No obstant una anàlisi d’aquest fenomen ens ha permès descriure com aquesta permreabilització resulta beneficiosa en el si d’un biofilm tractat amb betalactàmics, degut a que AmpC quedaria reclòs dins la seva matriu. Finalment, les dades preliminars suggereixen que la permeabilització que experimenta AmpC al mutant nfxB ocorre també amb altres betalactamases, particularment de les classes B i D