Study of relevant factors in the treatment of effluents by fungi for the degradation of emerging contaminants

Els contaminants emergents són un ampli grup de compostos orgànics detectats en diversos compartiments ambientals. Tot i que la seva concentració normalment està compresa entre els ng/L fins a pocs µg/L (força inferior que els contaminants orgànics convencionals), poden representar una amenaça per a la salut humana i el medi ambient. D’entre tots els contaminants emergents, els principis actius dels fàrmacs (PhACs) i els compostos disruptors endocrins (EDCs) generen una especial preocupació. Per altra banda, està àmpliament acceptat que la seva principal font d’entrada al medi ambient són els efluents de les plantes depuradores, on els tractaments convencionals de llots actius no són capaços de degradar-ne la majoria. Per tant, s’han de buscar tractaments alternatius. Una d’aquestes alternatives podria ser l’ús de fongs ligninolítics, aprofitant el seu sistema enzimàtic que els hi confereix l’habilitat de degradar un rang molt ampli de contaminants. Aquesta tesi avalua diferents aspectes relacionats amb la degradació de contaminants emergents per part de fongs. El fong de podridura blanca Trametes versicolor, àmpliament estudiat, és el que s’ha triat per a dur a terme els experiments d’aquesta tesi. Primer de tot s’ha estudiat la degradació individual de determinats contaminants. Tenint en compte que la degradació dels EDCs ha estat menys estudiada que la dels PhACs, es van seleccionar sis EDCs pertanyents als grups dels filtres UV (benzofenona-3 (BP3), benzofenona-1 (BP1) i 3-(4-metilbenzilidè) càmfor (4-MBC)) i dels benzotriazols (1H-benzotriazol (BTZ) i toliltriazol, una mescla de 4-metilbenzotriazol (4-MBTZ) i 5-metilbenzotriazol (5-MBTZ)). S’ha fet, doncs, un seguiment de la seva degradació per part de T. versicolor, la toxicitat aguda i les activitats estrogènica i de tipus dioxina, s’han identificat els metabòlits generats pel fong i s’han suggerit els primers passos de la via de degradació. A més a més, el destí de determinats contaminants (la BP3 i l’analgèsic i antiinflamatori diclofenac) durant la seva degradació per part del fong ha estat avaluada a través de compostos marcats amb l’isòtop estable 13C. La combinació d’anàlisis de la composició isotòpica del C del CO2 i de la biomassa total i el sondeig d’isòtops estables en aminoàcids (aa-SIP) han permès la discriminació entre simple transformació, mineralització oxidativa o incorporació del carboni a la biomassa. Pel que fa als dos compostos estudiats, els dos s’han mineralitzat però s’ha vist que només la BP3 s’utilitza com a font de carboni i és incorporada a la biomassa del fong. Per una altra banda, es van tractar dos efluents reals (l’aigua residual d’un hospital veterinari i el concentrat d’osmosi inversa d’una planta pilot de tractament d’aigües residuals urbanes) en un bioreactor de fongs fluïditzat per polsos d’aire i operat sota diferents condicions operacionals (estèril/no estèril i discontinu/continu) en vistes a una possible implementació futura. Amb aquesta intenció, aquesta tesi apunta a la importància de l’addició externa de nutrients i al control de l’aeració, els quals haurien de ser optimitzats per a obtenir una eliminació eficient de contaminants per part del fong inoculat. En aquesta tesi també es remarca la importància dels processos de conjugació i desconjugació. Per una banda, són una una restricció en l’avaluació de la degradació en efluents reals a causa de la seva absència en els mètodes analítics i, per l’altra, els conjugats representen uns metabòlits intermedis importants durant la degradació per part del fong dels contaminants seleccionats . També es van realitzar anàlisis de biologia molecular (anàlisi dels àcids grassos dels fosfolípids (PLFA), PCR quantitativa (qPCR) i gel d’electroforesis en gradient desnaturalitzant (DGGE)) amb l’objectiu de trobar alguna correlació entre l’operació dels bioreactors i el comportament del fong inoculat i els altres microorganismes que es desenvolupen en els bioreactors no estèrils. Els resultats suggereixen que els paràmetres de seguiment clàssics (com poden ser l’activitat lacasa) podrien no ser uns bons indicadors de la supervivència i predominança del fong inoculat.Emerging contaminants are a wide group of organic compounds detected in many environmental compartments. Even though their environmental concentration is usually in the range of ng L-1 to low µg L-1 (much lower than conventional organic pollutants), they still represent a threat to human health and the environment. Among emerging contaminants, pharmaceutically active compounds (PhACs) and endocrine disrupting compounds (EDCs) are of special concern. It is widely accepted that the main source to the environment are the effluents of wastewater treatment plants (WWTPs), where conventional activated sludge treatments are not able to degrade most of them. Therefore, alternative treatments should be found. One of those alternatives might be the use of ligninolytic fungi by taking advantage of their enzymatic system, that conferes them the ability to degrade a broad range of contaminants. The present thesis assesses different factors related to the fungal degradation of emerging contaminants. The widely studied white-rot fungus Trametes versicolor has been chosen to carry out all the experiments of this thesis. First of all, individual degradation of selected contaminants was studied. Taking into account that EDCs degradation has been less studied than PhACs, six EDCs belonging to the groups of UV filters (benzophenone-3 (BP3), benzophenone-1 (BP1) and 3-(4-methylbenzylidene) camphor (4-MBC)) and benzotriazoles (1H-benzotriazole (BTZ) and tolyltriazole, a mixture of 4-methylbenzotriazole (4-MBTZ) and 5-methylbenzotriazole (5-MBTZ)) were selected. Their degradation by T. versicolor, acute toxicity, estrogenic and dioxin-like activities were monitored, the fungal metabolites were identified and the first steps of the degradation pathway were suggested. Moreover, the fate during fungal degradation of certain contaminants (BP3 and the analgesic and anti-inflammatory diclofenac) was assessed by means of compounds labelled with the stable isotope 13C. Combination of analyses of carbon isotopic composition of CO2, bulk biomass and amino acids-stable isotope probing (aa-SIP) allowed the distinction between simple transformation, oxidative mineralization or carbon incorporation into the biomass. Regarding the two studied compounds, both of them were mineralized, but only BP3 was found to be used as carbon source and incorporated in the fungal biomass. On the other hand, two real effluents (veterinary hospital wastewater and a reverse osmosis concentrate from a pilot plant treating urban wastewater) were treated in fungal air-pulsed fluidized bioreactors under different operational conditions (sterile/non-sterile and batch/continuous) in view of a possible future implementation. With respect to that, the present thesis points out the importance of an external addition of nutrients and the control of aeration, which should be further optimized for an efficient removal of contaminants by the inoculated fungus. The importance of conjugation and deconjugation processes is also highlighted in this thesis. They are a restriction in the assessment of emerging contaminants degradation in real effluents due to the absence of conjugates in the analytical methods and, at the same time, conjugates are important intermediate metabolites in the fungal degradation of the selected contaminants. Molecular biology analyses (phospholipid fatty acids analysis (PLFA), real-time PCR (qPCR) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)) were performed as well with the aim of finding some correlation between the operation of the bioreactors and the performance of the inoculated fungus and the other microorganisms that could develop in the non-sterile bioreactors. Results suggest that the classical parameters monitored (i.e. laccase activity) might not be good indicators of inoculated fungus survival and predominance