Development of 3D cancer models to obtain mechanistic insights into disease progression

El càncer és una malaltia dinàmica durant la qual les cèl·lules proliferen, es diferencien i migren accedint a programes genètics i epigenètics reminiscents de l’embriogènesis. Aquest procés està dirigit per la comunicació bidireccional entre les cèl·lules cancerígenes i el microambient tumoral que està format per una matriu extracel·lular (ECM) tridimensional (3D) i cèl·lules de l’estroma, incloent fibroblasts, cèl·lules del sistema immune i del sistema vascular. Moltes biomolècules i enzims (ex. citoquines, factors de creixement i proteases) són contínuament secretades per les cèl·lules cancerígenes i de l’estroma, influenciant-se entre elles i modificant l’estructura i composició de l’ECM. Aquests canvis ambientals provoquen plasticitat i heterogeneïtat cel·lular. En el camp d’enginyeria de teixits, els investigadors intenten deconstruir el microambient tumoral en models cel·lulars 3D més simples i predictius que permetin analitzar el paper de senyals químics, mecànics i/o físics en la progressió de la malaltia. L’etapa més crítica de la progressió tumoral és la invasió i metàstasis, la qual provoca aproximadament el 90% de morts de càncer. Durant la present tesis, es van desenvolupar models 3D per recapitular la transició des d’un microambient 2D a un 3D que experimenten les cèl•lules cancerígenes quan s’escapen de la monocapa epitelial i envaeixen el teixit connectiu mesenquimal. Els experiments van demostrar que els cultius 3D van ser capaços de trencar l’organització epitelial, induint diferents fenotips tipus-mesenquimal dependent de la composició i rigidesa de la matriu. Per tant, les cèl·lules mostraven capacitat per adaptar-se a entorns canviants. A més, els cultius 3D provocaven la disminució de l’expressió de l’E-cadherina, suggerint la dissociació de les adhesions epitelials cèl·lula-cèl·lula i la conseqüent activació dels primers estadis de la transició epitelial-mesenquimal. Aquest patró d’expressió estava molt influenciat per la presencia i concentració dels motius d’unió de la ECM. Els mecanismes de regulació d’E-cadherina es van caracteritzar a nivell epigenètic i transcripcional. Els cultius 3D també poden contribuir al descobriment i avaluació terapèutica de nous tractaments anti-cancerígens. Part d’aquesta tesis es va focalitzar en investigar la teràpia fotodinàmica. En concret, els cultius 3D van emergir com valuoses plataformes per processos de cribratge de fotosensibilitzadors ja que van aconseguir recrear els gradients moleculars del fàrmac i l’oxigen. Aquestes condicions van crear un microambient protector per les cèl·lules localitzades en la part interior central del cultiu, causant una baixa eficàcia terapèutica i, per tant, mimetitzant les limitacions actuals de la pràctica clínica. En una altra part de la tesis, es va estudiar l’activitat de fàrmacs anti-cancerígens dirigits a inhibir determinats receptors de tirosina quinases. Els resultats van evidenciar que les cèl·lules desenvolupaven diferents estratègies de supervivència per escapar-se o evadir de l’efecte dels fàrmacs depenent de la composició de la matriu. Es va formular la hipòtesis que la ECM podia proporcionar a les cèl·lules accés a una gran i redundant xarxa de cascades de senyalització que complementaven l’activitat dels receptors bloquejats. Per tant, les cèl·lules cancerígenes presentaven un comportament adaptatiu sostingut gràcies al dinàmic i complex microambient tumoral. Aquesta sèrie de descobriments reforçava la necessitat de desenvolupar cultius 3D per estudiar els mecanismes de resistència dels fàrmacs.El cáncer es una enfermedad dinámica en la cual las células proliferan, se diferencian y migran accediendo a programas genéticos y epigenéticos reminiscentes de la embriogénesis. Este proceso está dirigido por la comunicación bidireccional entre las células cancerígenas y el microambiente tumoral que está formado por una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) y células del estroma, incluyendo fibroblastos, células del sistema inmune y células del sistema vascular. Muchas biomoléculas y enzimas (ej. citoquinas, factores de crecimiento y proteasas) son continuamente secretadas por las células cancerígenas y del estroma, influenciándose entre ellas y modificando la estructura y composición de la ECM. Esta serie de cambios ambientales provocan plasticidad y heterogeneidad celular durante el cáncer. En el campo de la ingeniería de tejidos, los investigadores intentan deconstruir el complejo microambiente tumoral en modelos celulares 3D más simples y predictivos con el objetivo de analizar el papel específico de señales químicas, mecánicas y/o físicas en la progresión de la enfermedad. La etapa más crítica de la progresión tumoral es la invasión y metástasis, la cual provoca aproximadamente el 90% de muertes. Durante la presente tesis, se desarrollaron modelos 3D para recapitular la transición desde un microambiente 2D a uno 3D que experimentan las células cancerígenas cuando se escapan de la monocapa epitelial e invaden el tejido conectivo mesenquimal. Los experimentos demostraron que los cultivos 3D eran capaces de romper la organización epitelial, induciendo diferentes fenotipos tipo-mesenquimales dependiendo de la composición y rigidez de la matriz. Por lo tanto, las células mostraban capacidad para adaptarse a entornos cambiantes. Los cultivos 3D provocaban la disminución de la expresión de la E-cadherina, sugiriendo la disociación de las adhesiones epiteliales célula-célula y la activación de los primeros estadios de la transición epitelial-mesenquimal. Este patrón de expresión estaba influenciado por la presencia y concentración de motivos de unión de la ECM. Los mecanismos de regulación de E-cadherina se caracterizaron a nivel epigenético y transcripcional. Los cultivos 3D también pueden contribuir al descubrimiento y evaluación terapéutica de nuevos tratamientos. Parte de esta tesis se focalizó en investigar la terapia fotodinámica. Los cultivos 3D emergieron como valiosas plataformas en procesos de cribado de fotosensibilizadores ya que pudieron recrear los gradientes moleculares de fármaco y el oxígeno. Estas condiciones crearon un microambiente protector para las células localizadas en la parte interior central del cultivo, causando una baja eficacia terapéutica y, por lo tanto, mimetizando las limitaciones actuales de la práctica clínica. En otra parte de la tesis, se estudió la actividad de fármacos anticancerígenos dirigidos a inhibir determinados receptores de tirosina quinasas. Los resultados evidenciaron que las células desarrollaron distintas estrategias de supervivencia para escaparse o evadir el efecto de los fármacos dependiendo de la composición de la matriz. Se formuló la hipótesis que la ECM podía proporcionar a las células acceso a una gran y redundante red de cascadas de señalización que complementan la actividad de los receptores bloqueados. Por lo tanto, las células cancerígenas presentaron un comportamiento adaptativo sostenido gracias al dinámico y complejo microambiente tumoral. Estos descubrimientos reforzaban la necesidad de desarrollar cultivos 3D para estudiar los mecanismos de resistencia a los fármacos. Cancer is a dynamic disease in which cells proliferate, differentiate and migrate by accessing to reminiscent genetic and epigenetic programs of embryogenesis. This process is driven by the crosstalk between cancer cells and tumor microenvironment, which comprises a three-dimensional (3D) extracellular matrix (ECM) and stroma cells including fibroblasts, vasculature and immune system cells. Effector biomolecules and enzymes (e.g. cytokines, growth factors and proteases) are continuously secreted by cancer and stroma cells, influencing each other and modifying the structure and composition of ECM. These environmental changes lead to cell plasticity and heterogeneity during cancer. In tissue engineering field, researchers try to deconstruct this complex tumor microenvironment into simpler and predictable 3D cell models in order to analyze the role of specific chemical, mechanical and/or physical signals in disease progression. The most critical tumor stage is local invasion and metastasis, which accounts for approximately 90% of all cancer deaths. In the present thesis, 3D cell models were developed to recapitulate the transition from a 2D to a 3D milieu that cancer cells experience when they escape from epithelial layer and invade mesenchymal connective tissue. Experiments revealed that 3D cultures compromised epithelial organization, inducing different mesenchymal-like phenotypes depending on composition and stiffness of scaffold. Therefore, cells showed the capacity to adapt to changing microenvironmental conditions. Moreover, 3D cultures induced E-cadherin downregulation, suggesting the disruption of epithelial cell-cell adhesions and the activation of early stages of epithelial to mesenchymal transition. Its expression pattern was influenced by the presence and concentration of ECM binding motifs. E-cadherin regulatory mechanisms were characterized at epigenetic and transcriptional level. 3D cultures can also help in the discovery and therapeutic assessment of cancer medicines. Part of this thesis work was focused in photodynamic therapy research. In particular, 3D cultures emerged as powerful platforms for photosensitizers screening processes since they could recreate molecular gradients for drug and oxygen. These conditions induced the development of a protective microenvironment for cells located in the core of the culture, accounting for the low therapeutic efficacy found in clinical practice. In a different part of the thesis, cancer drugs targeted to inhibit receptor tyrosine kinases activity were studied. Significantly, results evidenced that cells developed different survival strategies to evade or escape from drugs action depending on the composition of scaffold. We hypothesized that ECM could provide cells with access to a large and redundant spectrum of signaling pathways, complementing the activity of the blocked cellular receptors. Therefore, cancer cells presented an adaptive behavior supported by the dynamic and complex tumor microenvironment. These findings reinforced the necessity to develop 3D cultures to study cell resistance mechanism