Understanding the role of Toll-like receptors in the lower gastrointestinal tract

La mucosa del tracte gastrointestinal (TGI) constitueix la superfície de contacte més àmplia de l’organisme amb el medi extern. A la llum del TGI, la barrera epitelial permet la separació entre els bilions de microorganismes residents i els immunòcits. En aquest context, el manteniment de la tolerància a la microbiota resident és essencial per a preservar l’homeòstasi; qualsevol esdeveniment que causi la desregulació d’aquestes interaccions pot desencadenar respostes pro-inflamatòries com les observades a la malaltia inflamatòria intestinal (MII). Els receptors Toll-like (TLR) regulen el diàleg entre l’hoste i la microbiota, i s’han associat a la patogènesi de la MII. Tot i que inicialment foren descrits en immunòcits, la seva caracterització ha evolucionat ràpidament en els últims anys, i actualment s’accepta que els seus rols depenen àmpliament de les cèl·lules que els expressen. Aquest treball tracta diferents aspectes de la funció dels TLRs en el TGI, oferint una visió integrada del seu paper en diversos tipus cel·lulars i condicions particulars. La nostra investigació s’ha centrat en com l’estimulació dels TLR2/4/9 influencia les respostes de diferents tipus cel·lulars del TGI inferior en condicions fisiològiques i d’inflamació. Amb aquesta finalitat, hem estudiat l’expressió i distribució dels TLRs en un model murí de colitis induïda per dextrasulfonat sòdic (DSS), així com els efectes de l’administració intracolònica de diferents dosis de lligands dels TLR2/4. També hem avaluat el paper potencial dels TLR2/4/9 en cultius de sistema nerviós entèric (SNE) i cèl·lules enteroglials (CEG) en termes de producció de citocines, quimiotaxi i sensibilització de la producció de citocines en macròfags. Els nostres resultats demostren que els TLR2/4 tenen una àmplia expressió en condicions fisiològiques al TGI, i es troben incrementats durant la inflamació, especialment en colonòcits i immunòcits. L’administració intracolònica dels seus lligands en condicions fisiològiques no alterà els paràmetres clàssicament avaluats per al seguiment de la colitis. Per contra, la instil·lació de lipopolisacàrid (LPS) durant la inflamació amb un protocol específic atenuà els símptomes de colitis i reduí l’expressió dels TLR2/4 desregulats. El mecanisme efector sembla basat en afavorir la preservació epitelial promovent la proliferació de colonòcits. De fet, s’observà un increment de l’índex de preservació epitelial associat a augments en l’alçada de les criptes i en l’expressió de marcadors de proliferació en colonòcits de ratolins tractats amb DSS+LPS. Per altra banda, els nostres experiments també demostren que les CEGs expressen TLR4 funcional que activa la via de senyalització NF-κB post-estimulació amb LPS, induint l’alliberament de citocines i quimiocines, i incrementant la quimiotaxi d’immunòcits. Als cultius de SNE s’observaren respostes similars, malgrat que la presència de macròfags residents fa difícil quantificar la contribució de cada tipus cel·lular. Aquests cultius també expressen TLR2/9 funcionals, però no s’observaren respostes als seus lligands si no s’afegeixen en combinació amb LPS. De fet, l’estimulació dels TLR4/9 donà lloc a respostes sinèrgiques en la secreció de molècules solubles que després sensibilitzaren les respostes de macròfags, disminuint la seva producció de citocines pro-inflamatòries. Els resultats presentats en aquesta memòria contribueixen a millorar la comprensió de les funcions dels TLRs en el TGI inferior durant l’homeòstasi i la inflamació. Com a conclusió, el paper dels TLRs varia en funció del tipus cel·lular estimulat i el seu ambient. Algunes de les respostes dirigides pels TLRs, com les observades en cèl·lules epitelials, poden ser utilitzades per a modular la inflamació, però d’altres, com les de les CEGs, han de ser evitades per a prevenir l’exacerbació d’aquests processos. En aquest aspecte, la selectivitat és clau, i podria ser aconseguida a través d’una dosificació i uns protocols d’administració acurats.The mucosa of the gastrointestinal (GI) tract is the widest surface of the organism exposed to the external milieu. The epithelial barrier keeps trillions of microorganisms self contained within the GI lumen and separated from the immune cells. In this system, preservation of tolerance to resident microbiota is essential to maintain homeostasis; indeed, any event causing a dysregulation of these relationships might trigger pro-inflammatory responses such as those observed in inflammatory bowel diseases (IBDs). As the main receptors mediating the interplay between the host and the microbiota, Toll-like receptors (TLR) have been associated with the pathogenesis of IBD. Although initially described in immunocytes, knowledge regarding TLR expression and function has rapidly evolved in recent years, and it is currently accepted that their functions depend thoroughly on the cell type they are expressed in. The aim of this work was to approach some aspects of the function of TLRs in the GI tract, in an attempt to offer an integrated view on their role in different cell types in particular conditions. Specifically, our work has focused on how stimulation of TLR2/4/9 in different cell types populating the lower GI tract might influence their responses during homeostasis and inflammation. In order to achieve our objectives, we studied TLR expression and distribution in the context of the dextran sulphate sodium (DSS)-induced murine model of colitis, as well as the effects of intracolonic administration of different doses of TLR2/4 ligands. In addition, we assessed the putative roles of TLR2/4/9 in the enteric nervous system (ENS) and enteroglial cell (EGC) cultures in terms of cytokine release, chemoattraction and subsequent priming of TLR-induced cytokine expression in a macrophage-like cell line. Our results show that TLR2/4 display a wide expression thorough the lower GI tract in physiological conditions, and are up-regulated during inflammation, especially in colonocytes and immunocytes. Intracolonic administration of their ligands in physiological conditions had no apparent effects in the classical parameters used in assessment of colitis severity. Contrastingly, instillation of lipopolysaccharide (LPS) during inflammation in the described specific regime attenuated colitis severity and reduced expression of deregulated TLR2/4. The mechanism driving such effects seems to rely on increased epithelial preservation through induction of a proliferative response in epithelial cells, since higher epithelial preservation index was associated to increased crypt length and to enhanced expression of proliferation markers in colonocytes of DSS+LPS-treated animals. On the other hand, our findings additionally demonstrate that EGCs express functional TLR4 that activates the NF-κB signalling pathway after LPS challenge, inducing the release of cytokines and chemokines, and increasing chemoattraction of immunocytes. Similar responses were observed in ENS cultures, but the presence of resident macrophages in such cultures makes it difficult to quantify the participation of each cell type. ENS cultures had also functional TLR2/9, but no responses were observed to their ligands unless they were added in combination with LPS. Interestingly, upon TLR4/9 stimulation, synergistic responses were obtained in secretion of soluble molecules that subsequently primed the responses of macrophage-like cells, reducing their production of pro-inflammatory cytokines. The findings summarised in this manuscript contribute to improve the understanding of the functions that TLRs develop in the lower GI tract during homeostasis and inflammation. Overall, TLR roles may vary depending on the challenged cell type and its environmental situation. Some of the responses driven by TLRs can be used to modulate inflammation, such as those observed in epithelial cells, whereas some others must be avoided to prevent exacerbation of these processes (those in EGCs, for instance). Selectivity is the key, and might be achieved through accurate dosage and precise administration regimes