Investigación de Toxinas Naturales en Aguas y Alimentos mediante Cromatografí­a Lí­quida acoplada a Espectrometrí­a de Masas en Tándem

La presencia de contaminantes de origen natural en productos destinados al consumo humano ha suscitado una gran preocupación en los últimos años debido al mayor conocimiento de sus efectos nocivos para la salud humana. Por este motivo, los organismos responsables de velar por la salud de los ciudadanos, han decretado los niveles máximos permitidos de dichos contaminantes en alimentos y aguas. Se requiere pues metodología analítica que permita la determinación fiable de dichos contaminantes en las matrices correspondientes a los bajos niveles requeridos por la legislación. En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado el potencial analítico y la aplicabilidad del acoplamiento cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizador de triple cuadrupolo (QqQ), en el campo del análisis de tóxicos de origen natural en muestras alimenticias y mediambientales. El elevado potencial de esta técnica ha permitido el desarrollo de metodología analítica rápida, sensible, selectiva y fiable para la determinación de dichas toxinas. Además, todos los métodos de análisis desarrollados se han validado siguiendo los criterios de calidad recogidos en las guías europeas, desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo, con el fin de que los datos obtenidos presenten elevada fiabilidad. La investigación realizada en esta Tesis Doctoral se estructura en dos bloques, estudiándose en el primero de ellos las toxinas correspondientes al grupo conocido como micotoxinas, mientras que el segundo está dedicado a las ficotoxinas. Esta estructura se ha elegido para agrupar los trabajos según los tóxicos y el tipo de matrices estudiadas. En el primer bloque se han desarrollado metodologías para el análisis de micotoxinas en alimentos en su mayoría de origen agrícola. En el primer trabajo se ha estudiado el potencial de la cromatografía líquida de ultra resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (UHPLC-MS/MS) para el desarrollo de un método multianalito que permita la determinación simultánea de las micotoxinas legisladas, con propiedades físico-químicas muy diferentes, de manera rápida, sensible y selectiva. Se evaluó las diferentes opciones que permitieran realizar una correcta cuantificación de las muestras, seleccionando el calibrado en matriz como la opción más favorable. Esta metodología se validó y aplicó al análisis de diferentes muestras pertenecientes a cereales y alimentos infantiles. En el segundo trabajo se amplió el número de analitos, introduciendo micotoxinas estructuralmente relacionadas. Se estudió el potencial de esta técnica para el análisis de un elevado número de matrices utilizando la aproximación “dilute and shoot† con el objetivo de poder determinar simultáneamente todos los compuestos seleccionados en una única inyección. Se consiguió validar la metodología analítica para todos los compuestos legislados a concentraciones inferiores a las establecidas por el reglamento de la Comisión Europea. Esta metodología se aplicó al análisis de muestras pertenecientes a un estudio de dieta total (EDT) de la Comunidad Valenciana mediante el cual se pretendió determinar la ingesta de este tipo de contaminantes en los productos de consumo más habituales en la población de esta región. El tercer y cuarto trabajo abordan distintos problemas analíticos surgidos en el desarrollo de la metodología multianalito. En el tercer trabajo se puso especial énfasis en aumentar la sensibilidad de la metodología analítica con el fin de determinar concentraciones sub-µg/kg de determinadas aflatoxinas y ochratoxina A en muestras de alimentos destinadas a bebés y niños de corta edad, según se establece en la regulación establecida por la Comunidad Europea. Se evaluó el uso de la extracción en fase sólida (SPE) como la opción que permite la preconcentración de los analitos y purificación de los extractos, comparando el uso de diferentes materiales. Se observó que los mejores resultados se obtenian mediante el uso de cartuchos de inmunoafinidad, destacando su elevada selectividad para las micotoxinas objeto de interés. En la última parte de este primer bloque se desarrolló metodología analítica para la determinación de la micotoxina patulina, la cual, debido a sus propiedades físico-químicas, no pudo ser incluida en los métodos multianalito. Debido a su elevada polaridad y bajo peso molecular se requirió una cuidadosa optimización del tratamiento de muestra, así como de las condiciones cromatográficas y espectrométricas. Se comparó el uso de dos fuentes de ionización a presión atmosférica, la ionización electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI). Mediante el uso de la APCI se consiguió minimizar los problemas de supresión iónica debidos a la matriz observados en la fuente ESI. De este modo se consiguió la determinación de este compuesto en productos derivados de manzana, tanto sólidos como líquidos. En el caso de los productos sólidos se realizó una extracción sólido-líquido, mientras que en el caso de las muestras líquidas se llevó a cabo la inyección directa en el sistema cromatográfico tras una etapa de dilución. El segundo bloque aborda el análisis de ficotoxinas en muestras ambientales y alimenticias. En el primer trabajo de este bloque se desarrolló metodología analítica para la determinación de microcistinas y nodularina, toxinas procedentes de algas cianobacterianas, en aguas superficiales y de consumo. En este caso, al igual que en las micotoxinas, se pretendía desarrollar un método multianalito que permitiera la detección simultánea de la nodularina y las seis microcistinas seleccionadas. Se estableció el objetivo de poder determinar cada una de las toxinas seleccionadas a concentraciones inferiores a 1 µg/L (límite máximo establecido en la legislación Española para la microcistina LR). El procedimiento desarrollado incluyó una etapa de pre-concentración de los analitos en línea con el sistema UHPLC-MS/MS, el cual, con la inyección de 1 mL de muestra y de una manera totalmente automatizada, consiguió alcanzar las concentraciones deseadas. Para finalizar, en el segundo trabajo de este bloque se desarrolló metodología analítica basada en cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de másas en tándem (HPLC-MS/MS) para la determinación simultánea de toxinas marinas pertenecientes a diferentes grupos o familias. Este hecho aumentó la dificultad de la tarea ya que se pretendía la determinación de compuestos iónicos simultáneamente con compuestos de mayor apolaridad mediante cromatografía de fase reversa. Para ello se hizo uso de cromatografía de pares iónicos con el objetivo de aumentar la retención de los compuestos iónicos. Esta metodología se aplicó al análisis de muestras de vieiras contaminadas naturalmente en un “bloom† de algas tóxicas y sometidas posteriormente a un proceso de depuración, en las que se detectó la presencia de ácido domoico. El estudio de la concentración de ácido domoico en muestras tomadas a diferentes días posteriores a su contaminación permitió establecer la cinética de depuración de este contaminante en este tipo de organismos bivalvos