Eficàcia deIs desinfectants de I'aigua sobre Legionel·la spp. i les seves amebes hostes = Efficiency of water disinfectants against Legionella spp. and their amoeba hosts

Les infeccions causades per Legionella són un greu problema de salut pública al nostre país. La majoria de casos esporàdics i de brots epidèmics es relacionen amb aigües de consum que han estat sotmeses a un o més processos de desinfecció. Tot i això, Legionella spp. no només és capaç de sobreviure a aquests tractaments sinó que es multiplica al llarg dels sistemes de distribució convertint-se en un risc ambiental. Els principals factors que afavoreixen la supervivència i multiplicació de Legionella als sistemes d’aigua resideixen en la pròpia biologia del bacteri, que ha demostrat en moltes ocasions ser resistent a condicions físico-químiques extremes, així com les interrelacions que estableix amb altres microorganismes com els protozous, amb els que comparteix hàbitat. Els protozous, i en concret les amebes de vida lliure dels gèneres Acanthamoeba o Hartmannella s’han descrit en els últims anys com habitants freqüents dels sistemes de distribució d’aigua. Aquestes sobreviuen a condicions adverses mitjançant la formació d’estructures de resistència anomenades cists. La font nutricional de les amebes són els bacteris els qual fagocita i digereix. Tot i això, alguns d’aquests bacteris han desenvolupat estratègies per sobreviure la digestió amebiana i no sols això sinó que com en el cas de Legionella, poden fins i tot aprofitar els resursos cèl•lula hoste per multiplicar-se. A més, en estat endosimbiont Legionella queda protegida de l’efecte de desinfectants fet que podria originar una ràpida recolonització dels sistemes d’aigua un cop acabats els tractaments de desinfecció. Tres dels desinfectants més utilitzats a nivell europeu per tractar l’aigua de consum són el clor, la temperatura i la radiació UV. Tot i que el seu ús està regulat en nombroses normatives estatals, aquestes s’apliquen sense tenir en compte les amebes de vida lliure i les interrelacions que aquestes poden tenir amb altres microorganismes. L’objectiu principal d’aquest treball va ser estudiar l’eficàcia d’aquests tres desinfectants de l’aigua aplicant les mateixes condicions d’estudi sobre Legionella spp.; amebes de vida lliure en els dos estats de vida, trofozoïts i cists; i sobre els simbionts que estableixen Legionella i Acanthamoeba. En primer lloc es van obtenir soques de Legionella spp., i amebes de vida lliure de diferents orígens, tant ambientals com de col•lecció i es van optimitzar els protocols de cultiu dels diferents microorganismes, especialment pel que fa a les amebes. A continuació es van posar a punt mètodes quantitatius que ens permetessin comparar la viabilitat cel•lular després de cada tractament amb els tres desinfectants. I es van establir les condicions d’assaig per a cada un dels desinfectants. Finalment es van establir co-cultius per observar si l’associació entre Legionella i Acanthamoeba modificava d’alguna manera l’eficàcia dels desinfectant envers aquests dos microorganismes. La formació de co-cultius i el seu monitoreig mitjançant la tècnica del FISH ens va permetre observar com la soca de Legionella passava d’un estat plactònic a un estat d’emdosimbiont a l’interior dels trofozoïts. Analitzant la susceptibilitat de les diferents soques de Legionella, d’amebes de vida lliure, tan en estat de trofozoït com de cist, així com de Legionella com a endosimbiont d’Acanthamoeba per cadascun dels tractaments aplicats, es van proposar diferents models per descriure’n la cinètica d’inactivació. A partir d’aquí els resultats obtinguts es van comparar amb altres estudis publicats i se’n van extreure unes conclusions finals. Els resultats mostraren que clor, temperatura i radiació UV tenen un efecte desinfectant diferent pel que fa a les diferents soques de Legionella i amebes de vida lliure. Les diferències observades entre els diferents tractaments poden ser atribuïbles a la concentració de desinfectant, el temps d’exposició i a les diferències intrínseques de cada soca per cada microorganisme utilitzat. Pel que fa a la susceptibilitat de les amebes, trofozoïts i cists es van comportar de maneres diferents, sent els trofozoïts més sensibles que els cists. Finalment, L. pneumophila va resultar ser més resistent als tractaments amb desinfectants aplicats associada a trofozoïts d’Acanthamoeba en comparació amb el bacteri en condicions axèniques. Per tant, a l’hora d’aplicar tractaments de desinfecció, cal tenir en compte la complexa ecologia de Legionella com a endosimbiont d’amebes perquè aquests siguin eficaços i evitar així processos de recolonització.Legionella infections are serious problem which causes concern to health public services in our country. Despite all measures and controls realized, most sporadic cases and outbreaks have been related to drinking water systems that have been subjected to one or more disinfection processes. Legionella spp., not only survive these treatments but multiplied over the distribution system becoming a potential environmental hazard. The main factors that promote Legionella survival and proliferation in water systems are the bacteria biology itself, since Legionella is able to survive under a wide range of environmental conditions, as well as the relationship that Legionella establishes with other microorganisms that live in the same habitat as protozoa. Protozoa, and specifically free-living amoebae of the genera Acanthamoeba and Hartmannella have been described as common inhabitants of drinking water distribution systems. These amoebae survive in front harsh environmental conditions by forming resistant structures called cysts. Amoebae feed mainly on bacteria which are engulfed by phagocitosis and digested intracellularly. However, some of these bacteria have developed some strategies to survive amoebae digestion and some of them, as Legionella are able to use host cellular resources to multiply within it. In addition, as an endosimbiont, Legionella remains protected from disinfectants which could lead to a rapid recolonization of water distribution systems once disinfection treatments have been applied. Three of the most commonly used water disinfectants in Europe for drinking water treatment are chlorine, temperature and UV radiation. Although its use is regulated by many national guidelines, its efficacy relies mainly on bacterial inactivation without considering other microorganisms such as free living amoebae and its relationships with other microorganisms as Legionella. Therefore, the main objective of this work was to study the effectiveness of these three water disinfectants applying the same study conditions, on Legionella spp.; free-living amoebae considering its two life stages; and on the simbionts between Legionella and Acanthamoeba. First of all, several strains of Legionella spp., and free-living amoebae from different origins (environmental and from culture collections) were obtained and culture protocols were optimized, especially for free-living amoebae. Second, test conditions were established for each of the disinfectants and a quantitative method was implemented in order to compare cell viability after every disinfection treatment. Finally, to see whether the association between Legionella and Acanthamoeba modifies the effectiveness of the three disinfectants towards these two types of microorganisms, co-cultures of Legionella and Acanthamoeba were realized. Co-culture formation was monitored by using a FISH method, which led us observe how axenic Legionella changed to an intracellular state within Acanthamoeba trophozoites. Analyzing the susceptibility of the Legionella spp. strains; free-living amoebae strains, either trophozoites and cysts stages; as well as Legionella as an Acanthamoeba endosymbiont, for each of the treatments applied, inactivation kinetics models were proposed. Results obtained were compared with studies published by other authors and final conclusions were considered. Results showed that, chlorine, temperature and UV radiation have a disinfectant effect on the different Legionella strains used, as well as on free living amoebae. Differences on the disinfectant effect could be atributted to disinfectant concentration, exposure time and strain intrinsic characteristics. Regarding free living amoeba, trophozoites and cysts had a significantly different behaviour, being trophozoites more sensitive to disinfectants than cysts. Finally, L. pneumophila as and endosymbiont of amoeba strains showed a greater resistance to disinfectant compared with the axenic state. Because of that, when applying disinfections treatments, the complex ecology of Legionella as an amoeba endosymbiont should be considered in order to prevent a system recolonization