Disferlinopatías: nuevos aspectos diagnósticos y terapéuticos

La disferlina es una proteína que se expresa en el músculo esquelético humano. Aunque su función no se conoce completamente, se sabe que participa en la reparación de la membrana tras una lesión externa. Los pacientes con un déficit de disferlina sufren una distrofia muscular lentamente progresiva para la que no se conoce tratamiento alguno. En esta tesis hemos investigado nuevos aspectos diagnósticos y terapéuticos de esta enfermedad. Hemos demostrado que el estudio de la expresión de disferlina en monocitos de sangre periférica es una técnica útil para detectar pacientes con la enfermedad. Esta técnica es rápida, ya que se puede obtener un resultado en 48 horas, y evita la realización de biopsias musculares en pacientes con una disferlinopatía, aportando además material genético suficiente para poder detectar la presencia de mutaciones. Existen diferentes patrones de expresión de disferlina: los pacientes con dos mutaciones tienen niveles de entre un 0 y un 20%, los portadores de una única mutación tienen una expresión de entre el 20 y el 80% y en personas sin mutación en el gen de la disferlina los niveles se encuentran por encima del 80%. Hemos demostrado que existe una buena correlación entre la expresión de disferlina en monocitos y en músculo, siendo así una buena herramienta para confirmar la efectividad de tratamientos destinados a incrementar la expresión de disferlina. Desde el punto de vista terapéutico hemos investigado dos opciones diferentes. Por un lado hemos demostrado que la vitamina D es capaz de incrementar la expresión de disferlina tanto en monocitos como en miotubos de individuos portadores de una mutación en el gen de la disferlina in vitro. Estos resultados han sido confirmados in vivo gracias a la realización de un ensayo clínico con vitamina D en portadores de una mutación en el gen de la disferlina. Por otro lado hemos demostrado como el trasplante de un tipo de célula madre, los mesoangioblastos (MABs), es efectivo en un modelo murino de la enfermedad. Los MABs fueron aislados desde biopsias musculares de ratones sanos adultos e inyectados por vía intra-arterial en ratones A/J SCID deficitarios en disferlina. Estas células colonizaron los músculos enfermos, fusionaron con las fibras musculares enfermas y recuperaron la producción de disferlina. Este cambio, indujo una mejoría funcional notable, permitiendo que las fibras musculares fuesen capaces de reparar la membrana. Dado que los MABs son un subtipo de pericitos, células periendoteliales presentes en el músculo esquelético, estudiamos si los pericitos participan en el proceso de regeneración muscular in vivo en los músculos distróficos. Hemos observado que esta población celular está incrementada en biopsias distróficas, existiendo una buena correlación entre el número de células y el grado de destrucción y regeneración observado en las biopsias. Estas células expresan in vivo marcadores de diferenciación a músculo, como el factor MyoD, y son capaces de fusionar con miotubos in vitro, participando en el crecimiento de los mismos. Estos datos sugieren que los pericitos pueden participar en el proceso de regeneración muscular que tiene lugar en las distrofias musculares.Dysferlin is a protein expressed in the skeletal muscle. Despite its function is not completely known yet, it seems that participate in the process of membrane reparation after a damage. Patients with mutation in the dysferlin gene develop a muscle dystrophy characterized by a progressive weakness of the muscles of the lower and upper limbs. There is not any effective treatment for this disease yet. In the present thesis we have studied diagnostic and therapeutics aspects of the disease. We have demonstrated that the study of the expression of dysferlin in monocytes from peripheral blood is useful to detect patients with dysferlinopathy. This technique is quick, a result can be obtained in less tan 48 hours, as avoid the need of a muscle biopsy in patients affected. Moreover, it allows the study of mutations in the dysferlin gene. There are different patterns of expression of dysferlin related to the number of mutation present in the gene. In patients with two mutations, levels are between 0 and 20%. In carriers of one mutation in the gene, levels of expression are between 20 and 80% and finally in patients with no mutation in the dysferlin gene, levels are higher than 80%. We have also demonstrated that there is a good correlation between the expression of dysferlin in monocytes and in skeletal muscle. For this reason, we think that the study of dysferlin expression in monocytes could be a good tool to follow-up patients treated with drugs able to increase the expression of dysferlin. From a therapeutic point of view we have investigated two different options. We have demonstrated that vitamin D is able to increase the expression of dysferlin both in monocytes and in myotubes of carriers of a single mutation in the dysferlin gene in vitro. These results have been confirmed in vivo trough a clinical trial where healthy carriers of a single mutation in the dysferlin gene have been treated with vitamin D. We have also demonstrated that transplantation of mesoangioblasts (MABs), a mesenchymal stem cell, is effective in a murine model of the disease. MABs were isolated from muscle biopsies of adult healthy mice and injected into the femoral artery of A/J SCID mice. The cells were able to colonize the skeletal muscle, fusing with the regenerating muscle fibres and restoring the expression of dysferlin. Moreover, we demonstrated that this new dysferlin was completely functional, because muscle fibres treated were able to repair the membrane after an external damage. In view that MABs are a subtype of pericytes, periendothelial cells present in the normal skeletal muscle, we wondered if these cells are able to participate in the normal process of muscle regeneration. We observed that the population of pericytes is increased in dystrophic muscle biopsies of our patients. There was a good correlation between the degree of muscle regeneration and degeneration an the number of pericytes in the biopsy. We have observed that pericytes expressed transcription factors specific of skeletal muscle differentiation pathway in vivo, as for example MyoD. Finally, these cells were able to activate the skeletal muscle differentiation process and fuse with mature myotubes in vitro, suggesting that they are able to fuse with regerenerating muscle fibers in vivo, and participating in the normal process of muscle regeneration in humans