Effect of high hydrostatic pressure processing on biogenic amines formation in artisan caprine and ovine raw milk cheeses

El objetivo comprendido en esta tesis doctoral fue evaluar el efecto de la aplicación de la Alta Presión Hidrostática (APH) en la formación de Aminas Biogenas (AB) en quesos elaborados a partir de leche cruda. Para este propósito fue necesaria la participación de dos queserías artesanas como proveedoras de las dos variedades de queso elaboradas a partir de leche cruda utilizadas en este estudio, una de leche de oveja y otra de de leche de cabra. La visita a cada una de las queserías se realizó previamente con el fin de conocer las instalaciones, las condiciones de elaboración de los quesos y el grado de cumplimiento de la gestión del autocontrol. Los quesos fueron ajustados a las dimensiones de la canasta del equipo de APH, envasados al vacío y tratados por APH a 400 MPa de presión, durante 10 min, y 2 ºC de temperatura. Estas condiciones fueron aplicadas a los quesos entre los días 3 y 7 (APH1) y al día 15 (APH15) después de la elaboración. En cada caso se realizaron, durante la maduración, los análisis necesarios para conocer el efecto de cada tratamiento en la microbiología, los parámetros fisicoquímicos, el contenido de AB y las características sensoriales y de textura de los quesos. Así mismo, se estudió la capacidad formadora de AB en la microbiota presente en cada una de las variedades de queso. Para este propósito se realizó la validación de un método cualitativo para la detección de bacterias con actividad aminoácido decarboxilasa y se evaluó la frecuencia de las diferentes especies y cepas bacterianas encontradas con esta capacidad. El sistema de higiene y calidad basado en los principios del análisis de peligros y puntos críticos de control (APPCC) observado en cada quesería participante no está propiamente implantado. Sin embargo en ambas queserías se aplica, de diferentes maneras, el programa de pre-requisitos, aunque en algunos casos estos procedimientos y controles no estén por escrito y/o registrados. Los principales puntos débiles encontrados en ambas queserías fueron: El mantenimiento preventivo de instalaciones y equipos; los procedimientos de limpieza y desinfección; y la gestión y eliminación del lactosuero. Adicionalmente, en una de las queserías se observó que el control de la calidad del agua suministrada era inadecuado. En ambos tipos de queso se observó que la aplicación de APH influyó en el contenido de AB, mostrando una reducción, en comparación con la muestra control, alrededor del 75 y 35% en los quesos con tratamiento APH1 y APH15, respectivamente. La tiramina (TY) y la putrescina (PU) fueron las aminas más afectadas en los quesos elaborados de leche cruda de cabra, mientras que la TY y la cadaverina (CA) lo fueron en los quesos de leche cruda de oveja. La disminución en la concentración AB en los quesos presurizados al inicio de la maduración pudo deberse a la reducción observada en los recuentos microbianos un día después de la aplicación del tratamiento (principalmente lactococos, lactobacilos, enterococos y enterobacterias), junto con en el descenso del contenido de aminoácidos libres percibido, 34 y 48% menor que el obtenido en los quesos control de leche de cabra y oveja al final de la maduración, respectivamente. Por otro lado, la aplicación del tratamiento APH15 mostró también una reducción significativa en los recuentos microbianos. Sin embargo el contenido de aminoácidos libres observado fue similar a los quesos control. Los dos medios decarboxilantes, bajo en nitrógeno (LND) y bajo en glucosa (LGD), utilizados en el método cualitativo para la detección de bacterias con actividad aminoácido decarboxilasa mostraron parámetros de diagnostico satisfactorios para la identificación de bacterias con la capacidad de formar PU, CA y TY, siendo su optimo punto de corte fijado entre 10-25 mg L-1, con un área bajo la curva ROC superior al 0,90 y unos valores de sensibilidad y especificidad superiores al 84 y 92%, respectivamente. No obstante, este método mostró menor capacidad en la detección de bacterias con la habilidad de producir HI, siendo considerada, de acuerdo con los parámetros de diagnostico evaluados, como aceptable y deficiente, para los medios LND y LGD, respectivamente. La mayor actividad aminoácido decarboxilasa observada entre las bacterias aisladas de los quesos de leche de cabra y oveja fue la tirosina decarboxilasa, con una capacidad de producción de TY superior a 100 mg L-1, seguida por la lisina y la ornitina decarboxilasa, con una habilidad de formación de CA y PU en concentraciones de 100-1000 mg L-1 y superiores a 1000 mg L-1, respectivamente. Los principales microorganismos productores de TY mostraron ser aquellos pertenecientes a los grupos de Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus y Leuconostoc, mientras que las cepas bacterianas de Enterobactericeae y Staphylococcus fueron las principales formadoras de CA y PU, aunque algunas cepas de Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, y Pediococcus mostraron tener capacidad de producir diaminas a niveles superiores de 100 mg L-1. En lo referente a las características sensoriales y de textura, los quesos tratados con APH muestran una reducción de la fracturabilidad. Este hecho pudo ser debido a los cambios en la microestructura causados por la aplicación de APH y, en el caso de los quesos presurizados, al inicio de la maduración posiblemente también a la disminución en la velocidad de proteólisis producida. Por otro lado, en la evaluación sensorial de la textura, las diferencias significativas percibidas fueron únicamente encontradas en la firmeza de los quesos, siendo consideradas las muestras presurizadas como más firmes que los quesos control. La determinación de color mostró que la diferencia total (ΔE) de las muestras tratadas en comparación con los controles fue mayor después de la aplicación de APH (alrededor de 4.4), sin embargo esta diferencia fue disminuyendo a medida que la maduración avanzaba. Así mismo, la diferencia de color percibida por el panel de evaluación sensorial, fue significativa únicamente en las muestras de leche de oveja con tratamiento APH1.The aim of this work was to evaluate the effect of the High Hydrostatic Pressure (HHP) on the formation of Biogenic Amines (BA) in raw milk cheeses. For this purpose, two Spanish artisan cheese factories were selected to provide the cheeses to be used in the survey. These factories were previously visited to check the compliance with the hygienic standards required by European Regulations. One variety of cheese was chosen from each factory, both made from raw milk. One of them was made from ovine milk and the other from caprine milk. A HHP treatment of 400 MPa during 10 min at 2 ºC was chosen as the most suitable. These conditions were applied at the begging of the ripening between 3rd and 7th day (HHP1) or on the 15th day (HHP15), in each case the effect of the treatments on the microbial, physicochemical, textural, and sensory parameters, as well as on the formation of different BA were assessed during the maturity period. The BA forming capacity of the microbiota present in the cheeses was also evaluated. To this purpose a qualitative screening method to detect the amino acid decarboxylase activity of bacteria was validated and the frequency of the different species and strains with this capacity was determined in either the ovine and caprine raw milk cheeses studied. The hygienic quality system based on the HACCP principles of the two visited artisan cheese factories was not strictly established. However, the prerequisites program was applied according to their necessities, although in most cases the procedures and results of the controls were not appropriately written or registered. The preventive maintenance of the facilities and equipments, cleaning and sanitation procedures, and the whey waste disposal were the main weaknesses found in both cheese factories. Besides, the water supply control was also unsuitable in one of them. Biogenic amine content in both types of cheeses was greatly influenced by HHP. The treatments applied on the beginning and on the 15th day of ripening displayed 75 and 35% lower amounts of BA, respectively, than those obtained in the control untreated samples, being TY and PU the most affected amines in caprine milk cheeses, while TY and CA were so in ovine milk cheeses. The BA reduction in the caprine and ovine HHP1-samples can be explained as a result of a significant decrease of microbiological counts observed one day after the HHP-treatment (specially in the lactoccocci, lactobacilli, enteroccocci and enterobacteria groups) and the slower proteolysis detected in these samples, which showed 34 and 48% less free amino acids than the control caprine and ovine milk cheese samples at the 60th day of ripening, respectively. On the other hand, the HHP treatment applied on the 15th day also resulted in the decrease of microbiological counts, although in this case the liberation of amino acids was not different than the control samples. The amino acid decarboxylase microplate screening method using low nitrogen decaboxylase (LND) and low glucose decaboxylase (LGD) broths had satisfying diagnostic parameters to detect the PU, CA and TY- forming bacteria, being their optimal cut off between 10-25 mg L-1, with an area under ROC curve above 0.90 and a sensitivity and specificity values above 84 and 92%, respectively. Nevertheless, the test had less capacity to detect the HI-forming bacteria. According to the diagnosis parameters evaluated, this test was considered only as acceptable and poor, for LND snd LGD media, respectively. Among the isolates obtained from caprine and ovine milk cheeses with amino acid decarboxylase activity, the TY forming bacteria were the most frequent, showing a strong production (exceeding 100 mg L-1), followed by those with CA and PU-forming ability with strong and prolific production (100-1000 and over 1000 mg L-1, respectively). In the first case, strains belonging to the Lactococcus, Lactobacillus, Enterococcus and Leuconostoc groups were found as the main TY producers, whereas Enterobactericeae and Staphylococcus strains were the main PU and/or CA forming bacteria, although some Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, and Pediococcus strains showed an ability to produce diamines at levels above 100 mg L-1. The decelerated rate of proteolysis in HHP1 samples, combined with the structural changes caused by the pressure, could contribute to reduce the fracturability of cheeses. However, this decrease could be only due to the formation of a more homogeneous microstructure in the ovine milk cheeses with the HHP15 treatment. The sensory panel noticed that the firmness in the HHP1 and HHP15 samples was significantly different than in control samples. The total color differences (ΔE) in the HHP samples was higher during the first stages of the ripening (around 4.4 in HHP1 and HHP15 samples), decreasing as the sample aged. In addition, differences in color were also perceived by the sensory panel, being significant only in ovine milk cheeses with the HHP1-treatment