Identificació de nous marcadors moleculars en metàstasi hepàtica de càncer colorectal

L’objectiu d’aquest treball és la identificació i caracterització de les principals alteracions en metàstasi hepàtica (MH) de càncer colorectal (CCR) tant a nivell d’expressió gènica com de metilació de l’ADN. Els resultats obtinguts han de servir per millorar la comprensió del procés metastàtic i aportar nous coneixements que puguin ser aplicats en el diagnòstic molecular i en la recerca de noves opcions terapèutiques. Els resultats de la tesi estan estructurats en 2 articles: “LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació de marcadors moleculars d’expressió gènica importants en el procés metastàtic. 19 mostres aparellades de tumor primari de còlon i MH han estat hibridades en un microarray de cDNA (Affymetrix). S’obté un llistat de 1374 sondes diferencialment expressades de forma significativa entre tumors i metàstasis. S’ha creat una signatura metastàtica (algoritme de Golub) que consta de 7 gens específics de MH: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. La capacitat de pronòstic de MH d’aquesta signatura en tumors i en mucosa normal de còlon també ha estat avaluada, mitjançant RT‐PCR quantitativa. Segons un anàlisi de regressió logística univariant, els gens MS4A12, CYP1B1 i CLCA4 estan significativament sobreexpressats en tumors metastàtics (n=61) en comparació amb els no metastàtics (n=40). L’anàlisi estadístic Random Forest, a partir dels nivells d’expressió de MS4A12 i CYP1B1 (en tumors i en còlon normal), permet pronosticar disseminació al fetge amb una probabilitat d’encerts del 80%. Ambdós gens mostren major expressió gènica en el component estromal que en el tumoral quan s’analitzen mostres de microdissecció per captura làser. D’altra banda, s’ha desenvolupat un model murí per injecció intraesplènica de línies cel∙lulars humanes de CCR (KM12C i HCT116) capaces de metastatitzar específicament a fetge reproduint així el procés de disseminació en pacients. “ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER” L’objectiu és la identificació d’alteracions en la metilació de l’ADN específiques de MH. S’han utilitzat dues metodologies: l’AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) i l’array de metilació. En cap cas s’han trobat diferències de metilació entre tumors primaris i MH aparellades. Tot i això, s’ha validat mitjançant seqüenciació per bisulfit i corbes de melting dues bandes d’AUMA amb canvis de metilació recurrents (28 i 33% dels casos) entre mucosa normal de còlon i tumors, anomenades banda B (19q13.32) i banda C (16p13.3). Per limitar l’àrea afectada per aquests canvis de metilació, s’ha fet seqüenciació per bisulfit de les illes CpG veïnes a les bandes B i C concloent que es tracta d’alteracions poc extenses dins el genoma. L’anàlisi transcripcional dels gens propers amb l’array d’expressió (Affymetrix) ens indica que no hi ha regulació de l’expressió gènica per metilació dins una regió de fins a 2Mb lluny de les bandes d’AUMA. Tot i la manca de significació, la línia cel∙lular HCT116 desmetilada (tractament amb AZA i TSA) ha servit per analitzar una possible correlació entre la metilació de les bandes B/C i l’expressió de gens propers. La majoria de gens analitzats estaven sobreexpressats en la línia tractada. Les conclusions principals d’aquesta tesi són dues: ‐ S’ha obtingut una signatura metastàtica de 7 gens específics de MH de CCR. Dos d’aquests gens, MS4A12 i CYP1B1, tenen capacitat per pronosticar MH, fet de gran importància clínica. ‐ No s’han trobat canvis de metilació específics de MH indicant que els canvis epigenètics succeeixen en estadis inicials de la tumorigènesis.Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide being liver metastasis (LM) a significant prognostic factor and the main cause of cancer related deaths. Despite of its clinical relevance, metastatic spread process is poorly understood. The aim of this study is to clarify the mechanisms of colorectal cancer LM discovering new molecular markers (transcriptional and epigenetic ones) with significant role in the metastatic process to improve its diagnostics, treatment and prevention. The results can be classified in 2 manuscripts: 1) LIVER METASTASIS SIGNATURE AS PROGNOSTIC GENES OF DISTANT DISSEMINATION IN STAGE III COLORECTAL CANCER 19 paired subjects (colorectal tumor/LM) have been used in cDNA microarrays (Affymetrix) in order to identify specific LM genes. A metastatic signature of 7 specific liver metastasis related genes has been built: MMP3, MMP1, CYP1B1, CLCA4, MS4A12, SPP1 i CEACAM7. Two of them, MS4A12 and CYP1B1, have an important liver metastasis prognosis capability which could be very useful in clinics for CRC prognosis. 2) ALU ELEMENTS’ METHYLATION ANALYSIS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER Specific liver metastasis (LM) epigenetic alterations would be interesting for better dissemination process understanding. Two different methodologies have been used: AUMA (Amplification of Unmethylated Alu) and methylation microarray. However, specific LM methylation changes have not been identified being, therefore, early events in adenoma‐carcinoma sequence