Efecte de la Peroxidació Lipídica sobre la Inflamació i la Trombosi

L'aterosclerosi és una malaltia progressiva que es caracteritza per una acumulació de lípids en el subentoteli vascular. Evidències observacionals suggereixen que la peroxidació lipídica, la resposta inflamatòria i els processos trombogènics tenen un paper important en la patogènesi de l'aterosclerosi i les seves complicacions clíniques. Diversos estudis han demostrat l'existència de LDL oxidades, d'alguns dels seus components oxidats, de nivells elevats de citocines proinflamatòries i del principal inductor de la trombosi, el factor tissular, en plasma de pacients d'alt risc cardiovascular i en plaques ateroscleròtiques humanes on també s'ha observat acumulació de cèl·lules inflamatòries. Malgrat aquests coneixements no es disposa d'evidències directes que relacionin la peroxidació lipídica amb la inflamació. Un fet remarcable en aquest àmbit és el potencial del PPAR en l'aterosclerosi. El PPAR és un receptor nuclear diana de les tiazolidinadiones, fàrmacs utilitzats en el tractament de la diabetis mellitus tipus 2. Aquests fàrmacs mostren un efecte global antiateroscleròtic en models animals d'aterosclerosi i en estudis clínics amb humans. A nivell in vitro s'ha demostrat que aquests fàrmacs poden tenir un paper antiinflamatori important. A més, PPAR s'expressa de forma elevada en plaques ateroscleròtiques on colocalitza amb lípids oxidats. Recentment s'ha suggerit que la LDL oxidada podria ser una font de lligands endògens del PPAR tot i que encara no s'han establert. Els estudis que es presenten en aquesta tesi doctoral engloben nous coneixements de la peroxidació lipídica en la patogènesi de l'aterosclerosi i en concret en la inflamació i la trombosi. I donen suport a la teoria que la modificació oxidativa dels lípids té un paper important en la progressió de la malaltia aterotrombòtica. Els resultats que s'exposen en aquesta tesi doctoral demostren que el 2,4-decadienal, un aldehid apolar producte final de l'oxidació dels àcids grassos poliinsaturats majoritaris de les LDL, contribueix a la coneguda citotoxicitat de la LDL oxidada en cèl·lules musculars llises humanes. L'efecte citotòxic observat no és promogut per apoptosi cel·lular donat que no es produeix la fragmentació del DNA característica d'un estat apoptòtic. El 2,4-decadienal i l'hexanal, un altre aldehid apolar, a concentracions no citotòxiques aturen el creixement cel·lular i disminueixen els nivells de mRNA dels gens p53 i c-myc que estan involucrats en la regulació de l'apoptosi. Aquests resultats suggereixen que la citotoxicitat dels aldehids podria explicar-se per un fenomen de necrosi cel·lular. D'altra banda ambdós aldehids augmenten els nivells de mRNA i de proteïna del factor tissular. Nosaltres suggerim que aquest efecte podria ser a través de l'activació del factor de transcripció AP-1 format pel complex cFos-cJun prèvia síntesi de novo de c-Fos. Aquest efecte es reverteix amb un tractament previ amb simvastatina, un fàrmac hipolipemiant amb propietats antioxidants i antitrombòtiques. Pel que fa a la implicació de PPAR en l'aterosclerosi, 1) hem identificat dos elements de resposta PPAR en el promotor del gen del TNF humà que suggereixen una implicació directa de PPAR en la inflamació. Aquest estudi aporta més dades al coneixement del mecanisme d'acció de les tiazolidinadiones i descriu una nova via de modulació de l'expressió del TNF; 2) proposem el 2,4-decadienal com a candidat a mediador de PPAR en la placa d'ateroma donat que els resultats obtinguts demostren que activa PPAR. Augmenta la translocació de PPAR del citosol al nucli i augmenta la transcripció regulada per PPAR; 3) aportem evidències que descartarien l'efecte proateroscleròtic (augment de CD36) no desitjable de les tiazolidinadiones en pacients diabètics tipus 2. Aquests pacients tenen nivells elevats d'àcids grassos lliures circulants i les dades obtingudes demostren que la darglitazona, una tiazolidinadiona, en presència d'àcids grassos lliures no altera l'expressió de CD36 ni en monòcits ni en macròfags humans i no modifica el contingut lipídic dels macròfags.Atherosclerosis is a progressive disease characterized by an accumulation of lipids in the subendothelial wall. Experimental evidence suggest that lipid peroxidation, inflammatory response and thrombogenic processes play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis and its clinical complications. Oxidized LDL particles, some of their oxidative compounds, elevated levels of proinflammatory cytokines and tissue factor (the main inducer of thrombosis) have been detected in plasma of patients with high cardiovascular risk. It has also been reported the presence of all these components in human atherosclerotic plaques where also has been observed an accumulation of inflammatory cells. However, no direct evidence exist about a direct relation between lipid peroxidation and inflammation. A recent interesting finding is the possible role of PPAR in atherosclerosis. PPAR is the nuclear receptor target of thiazolidinediones, drugs used in the treatment of non insulin dependent diabetes mellitus. These drugs have shown a net antiatherosclerotic effect in animal models and in clinical studies in humans. In vitro experiments have shown that thiazolidinediones may have an important antiinflammatory action. PPAR is overexpressed in atherosclerotic plaques where colocalizes with oxidized lipids. Recently, oxidized LDL has been pointed as an important source of PPAR ligands.The work presented in this thesis shows new knowledge of the lipid peroxidation role in the pathogenesis of atherosclerosis emphasized in the action on inflammation and thrombosis. In summary, the obtained results support the theory that lipid oxidative modification plays an important role in the progression of atherothrombotic disease.Results show that the apolar aldehyde 2,4-decadienal, an end product of the oxidation of the main polyunsaturated fatty acids present in LDL, contributes to the well-known toxicity of oxidized LDL in human smooth muscle cells. The cytotoxic effect observed may not be promoted by an apoptotic state because the characteristic DNA ladder is not induced. 2,4-decadienal and hexanal, another apolar aldehyde, at non cytotoxic concentrations produce cell growth arrest and decrease p53 and c-myc mRNA levels, genes involved in the regulation of apoptosis. These results suggest that the cytotoxicity of aldehydes may be explained by cell necrosis.On the other hand, both aldehydes increase tissue factor mRNA and protein levels. We suggest that this effect may be produced through the activation of the transcription factor AP-1 formed by the complex cFos-cJun and by previous synthesis of c-Fos. This effect is prevented by a pretreatment with simvastatin, a hypolipidemic drug with antioxidant and antithrombotic properties.Concerning PPAR implication in atherosclerosis, 1) we have identified two PPAR response like elements in the human TNF promoter which suggest a direct link between PPAR and inflammation. This study adds more data in the knowledge of the mechanism of action of thiazolidinediones and describes a new pathway to modulate TNFexpression; 2) we propose that 2,4-decadienal may be a PPAR mediator in the atheromatous plaque based on our results that show PPAR activation by 2,4-decadienal. 2,4-decadienal increases PPAR translocation from the citosol to the nucleus and increases the transcription regulated by PPAR; 3) we also show evidence that the non desirable proatherosclerotic effect (CD36 induction) of thiazolidinediones would not be produced in type 2 diabetic patients. These patients have high levels of circulating fatty acids and our results show that darglitazone, a thiazolidinedione, in the presence of fatty acids neither alters CD36 expression in human monocytes and macrophages nor modifies macrophage lipid content