Prevención de la arterioesclerosis: efectos celulares y moleculares de intervenciones dietéticas y farmacológicas

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de morbi/mortalidad en los países industrializados y también en los países en vías de desarrollo. El sustrato patológico más importante en la etiología de estas enfermedades es la formación de la placa ateromatosa y la subsiguiente trombosis, potenciados ambos por la presencia de factores de riesgo como la dislipemia, el tabaquismo y la hipertensión. Uno de los principales objetivos en la prevención de las enfermedades cardiovasculares es el tratamiento de la hiperlipemia. Esta tesis analiza las dos principales estrategias de prevención de las enfermedades cardiovasculares en la reducción de las concentraciones séricas de colesterol: la modificación de la dieta, centrándonos en un único componente de la dieta Mediterránea (el vino tinto), y el tratamiento con fármacos hipolipemiantes (pravastatina). El objetivo de esta tesis es investigar los mecanismos moleculares de acción de ambas estrategias preventivas en la inhibición del riesgo trombótico en el modelo experimental porcino de hipercolesterolemia inducida con dieta. Para evaluar el efecto antitrombótico del vino tinto y de la pravastatina se ha estudiado la deposición plaquetaria, desencadenada tras perfundir sustratos vasculares homólogos en una cámara de perfusión cilíndrica o reactor de flujo (Badimon L, 1987).Los animales se alimentaron durante 100 días con pienso hipercolesterolémico que simula la dieta de los países industrializados (2% de colesterol y 20% de grasas saturadas). Se estudiaron tres dosis de vino tinto (20, 30 y 40g alcohol/día), administradas junto a la ración diaria de pienso, en tres grupos diferentes de animales y se compararon con el grupo control (solamente pienso hipercolesterolémico sin ingesta de vino). Al finalizar el período experimental y tras realizar análisis bioquímicos y hematológicos los animales se sometieron al estudio de trombosis desencadenada por sustratos vasculares moderada y severamente lesionados. Se emplearon dos tipos de cámaras de perfusión para obtener las velocidades de flujo deseadas, 212 s-1 (velocidad baja, típica de arterias coronarias ligeramente estenosadas) y 1690 s-1 (velocidad alta, modelo de arterias coronarias estenosadas). También se analizaron los cambios en la traslocación de RhoA en las plaquetas y la expresión de factor tisular (FT) en monocitos. La deposición plaquetaria en la pared disminuyó significativamente en los animales que habían ingerido vino junto con el pienso comparados con los animales controles. La expresión de RhoA en el citoplasma plaquetario (forma inactiva) aumentó en los grupos con ingesta de vino, mientras que la expresión en la membrana plaquetaria (forma activa) disminuyó. La expresión de FT en los monocitos estimulados con LPS (lipopolisacárido) disminuyó en los animales que habían ingerido vino. Los niveles de colesterol no fueron significativamente diferentes entre los grupos de estudio.En el siguiente estudio los animales se alimentaron durante 100 días con pienso hipercolesterolémico, pero durante los 50 últimos días un grupo se trató con una dosis de 5mg/kg de pravastatina y el otro con placebo. Ambos grupos fueron comparados con el grupo control (animales que durante 100 días se alimentaron con pienso normocolesterólemico). Al finalizar el período experimental se evaluó el riesgo trombótico empleando un reactor de flujo (cámara) de segunda generación; una cámara de perfusión que permite una velocidad de cizalladura de 212s-1 con estenosis del 70% en la zona central (Badimon L, 1991). También se evaluó la expresión de RhoA en la membrana plaquetaria y la del FT en la pared vascular. El tratamiento con pravastatina inhibe significativamente la deposición plaquetaria sobre pared vascular lesionada (ligera y severamente) sin que se observe una diferencia significativa en los niveles plasmáticos de colesterol entre los dos grupos hipercolesterolémicos. Además la pravastatina redujo la expresión de RhoA en la membrana plaquetaria y la expresión de FT en la pared vascular de los animales tratados.Podemos concluir que el consumo moderado de vino y el tratamiento con pravastatina son capaces de disminuir el riesgo trombótico en condiciones de hipercolesterolemia sostenida, es decir, sin disminuir el aporte externo de colesterol y grasas saturadas. Esto significa que ambos actúan también por mecanismos independientes a la disminución de los lípidos plasmáticos, sugiriendo un efecto directo sobre la actividad de la plaqueta y la interacción plaqueta-pared vascular.Cardiovascular diseases cause more than 16 millions deaths every year. The main pathologic substrate for these diseases is the atherothrombotic process, a multifactorial and silent process that starts in the childhood and progresses through life. Clinical manifestation develops at the 3 or 4th decade of life. The velocity of progression and the severity of clinical manifestations depends on the presence of risk factors such as elevated plasmatic cholesterol, tobacco and hypertension. The main objective in preventing cardiovascular diseases is the management and treatment of hypercholesterolemia. In this Ph.D two principal strategies in prevention of cardiovascular diseases by reducing plasmatic cholesterol levels have been analyzed: diet modifications (focused in red wine as a component of Mediterranean diet) and treatment with lipid-lowering drugs (studies with pravastatin). The objective of this Ph.D is to investigate the molecular mechanisms of action of both preventive strategies in the inhibition of thrombotic risk in the porcine experimental model of cholesterol-clamp induced by diet. The antithrombotic effects of red wine and pravastatin in platelet deposition triggered by homologous vascular tissues have been analyzed in a ex vivo perfusion chamber (Badimon L, 1987).Animals were fed for 100 days with cholesterol rich diet similar to that ingested in western countries (20% saturated fats, 1% cholic acid and 2% cholesterol). Three doses of wine (20, 30 y 40g wine ethanol/day) were given to three different groups of animals and compared to the hypercholesterolemic control group. At the end of the experimental period and after biochemical and haematological controls, thrombotic risk was assessed by exposure of blood from studied animals to a thrombogenic damaged arterial vessel wall in the previously validated and standardized Badimon flow chamber. Two different perfusion chamber were used to achieve shear rates of 212/s (low shear, model of patent coronary arteries) and 1690/s (high shear rate, model of mildly stenotic coronary arteries). Perfusions were run over homologous porcine vessel wall with two types of damage: mild (aortic subendothelium, model of erosion) and severe, mechanically ruptured vessel wall (tunica media, model of severe injury). Platelet aggregation and changes in RhoA translocation, tissue factor (TF) gene-expression in not/induced monocytes, lipid plasma composition and LDL oxidazability (MCD, Maximal Conjugated Diene formation) were analyzed as possible targets of red wine activity. Blood thrombogenicity, measured as platelet deposition rate (Total Platelet Deposition /min of perfusion), was statistically reduced (PIn the second study, animals were fed a cholesterol-rich diet (2% cholesterol; 1% cholic acid; 20% beef tallow) for 100 days (hypercholesterolemic group). The hypercholesterolemic diet was administered during the first 50 days to induce sustained hyperlipemia derived from cholesterol absorption and, thus, diminishing cholesterol synthesis. Then, pigs started an oral daily treatment with pravastatin (5mg/kg) or placebo for the last 50 days of the hypercholesterolemic diet. A group of four animals was fed, for the same period of time, a commercial chow (normocholesterolemic group). At the end of the experimental period and after biochemical and haematological controls, thrombotic risk was assessed by exposure of blood from studied animals to a thrombogenic damaged arterial vessel wall in the previously validated and standardized Badimon flow chamber. Deposition of radio-labelled platelets was evaluated using a second generation flow chamber that allows a shear rate of 212/s with a 70% of stenosis in the central segment (Badimon L, 1991). RhoA expression in the platelet membrane and TF in the vascular wall were also evaluated. Pravastatin treatment significantly inhibits mural thrombosis triggered by both eroded and disrupted vessel wall without reducing plasma lipid levels in the hypercholesterolemic animals.The expression of RhoA in platelet membrane and TF expression in arterial wall were significantly reduced in animals treated with pravastatin.We can conclude that moderate wine intake and pravastatin treatment reduce thrombotic risk in cholesterol-clamp conditions, therefore mechanisms of action operate through pathways both dependent and independent from plasma cholesterol lowering effects suggesting a direct effect over platelet activity and platelet-vessel wal interaction