Les metal·loproteïnases de matriu en la isquèmia cerebral: origen, localització cel·lular i contribució al dany tissular

L'ictus o infart cerebral es produeix com a conseqüència d'una alteració del flux dels vasos sanguinis cerebrals. Actualment l'única opció terapèutica aprovada pel tractament de l'ictus isquèmic en la fase aguda és l'administració de l'activador recombinant del plasminogen tissular, el rt-PA. El rt-PA és un fibrinolític que junt amb el plasminogen endogen, forma un complex que s'uneix a la fibrina i la degrada dissolent l'èmbol i produint la recanalització de l'artèria. Desgraciadament, el rt-PA apart de dissoldre el coàgul també té efectes adversos com és l'increment del risc de patir transformacions hemorràgiques (TH) i efectes neurotòxics.Les Metal·loproteïnases de Matriu (MMPs) són una família d'endopeptidases que poden degradar diferents substrats que formen part de la matriu extracel·lular. Les MMPs juguen un paper fonamental tant a la fase aguda com a la fase crònica de l'ictus. Les MMPs poden contribuir al dany neuronal i vascular, al creixement de l'infart i a l'aparició d'hemorràgies durant la fase hiperaguda. Quines MMPs participen en cada un d'aquests processos i si tenen diferents funcions en els diferents temps després d'un esdeveniment isquèmic és quelcom que encara es desconeix.Així en aqustea Tesi Doctoral el nostre objectiu era respondre algunes d'aquestes qüestions i després dels diversos estudis presentats en aquesta tesi, varem concloure que:i. La Microdissecció Làser (LMD) és una tècnica pràctica i fiable que permet aïllar poblacions cel·lulars específiques del parènquima cerebral i que permet obtenir-ne petites quantitats de proteïna exclusives d'aquests tipus cel·lulars que poden ser analitzades per tècniques de proteòmica, com són la zimografia en gelatina, el western blot o els ELISA múltiples.ii. La infiltració de neutròfils a les zones infartades i hemorràgiques i els nivells locals elevats de MMP-9 es relacionen amb la degradació del col·lagen IV de la làmina basal i el trencament de la barrera hematoencefàlica. La MMP-9 vascular i de les cèl·lules inflamatòries està directament implicada en les complicacions hemorràgiques que segueixen a un ictus isquèmic.iii. El tractament amb rt-PA promou la degranulació dels neutròfils ex vivo i l'alliberació per part d'aquests de MMP-9, a més de MMP-8 i TIMP-2.iv. L'activació de les MMPs amb activitat gelatinasa/col·lagenasa es produeix en els primers instants després de la isquèmia, tan aviat com 30 minuts en el model d'isquèmia cerebral focal en rata. Aquesta actitivitat es localitza inicialment en el nucli de les cèl·lules i en temps més tardans també al citoplasma.v. La MMP-13 és activada al parènquima cerebral humà i de rata després d'una isquèmia cerebral i es troba fonamentalment en neurones però també en oligodendròcits i astròcits. Aquesta MMP-13, a més, es localitza majoritàriament en el nucli d'aquestes cèl·lules a la zona de l'infart. Així mateix, el tractament de deprivació d'oxigen i glucosa promou la seva localització nuclear en cultius neuronals.vi. MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13 i TIMP-1 es troben augmentades al cervell humà després d'un ictus isquèmic. En el cervell isquèmic, la MMP-9 i el TIMP-2 són produïts fonamentalment pel component vascular, mentre que la MMP-10 es produeix bàsicament en neurones.En conjunt, els resultats incrementen el coneixement tant de la patologia cerebrovascular isquèmica en si mateixa com del paper que juguen les MMPs en els diferents processos de la patofisiologia de la malaltia. Tot plegat els resultats identifiquen noves proteases implicades en els diferents tipus de dany que segueixen al fenòmen isquèmic, i a més, aporten un millor coneixement en la localització subcel·lular i de les cèl·lules productores d'aquestes MMPs tant en el parènquima cerebral com en la unitat neurovascular.Stroke or cerebral ischemia appears as a consequence of a blood flow alteration in brain blood vessels. Nowadays, the only therapy for ischemic stroke treatment during the acute phase is the administration of the recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA. This drug is a fibrinolytic that, together with the endogen plasminogen, makes a complex that binds fibrin and degrades this last one, dissolving as a consequence the blood clot producing the artery recanalization. Unfortunately, rt-PA, in addition to the therapeutical effect, presents as well dangerous sides effects such as the increment of hemorrhagic transformations (HT) and neurotoxic effects.Matrix Metalloproteinases (MMPs) are a family of endopeptidases that degrade different substrates of the extracellular matrix. MMPs play an important role in both acute and subacute phase of stroke. MMP may contribute to neuronal and vascular damage, infarct growth and hemorrhagic transformations during the acute phase. Which MMPs participate in each of these processes and their function in different periods after and ischemic event is something that remains to be elucidated.Thus, in the Doctoral Thesis we aimed to address some of these questions and after all the studies presented we concluded that:1. Laser Microdissection (LMD) is a reliable technique that allows us to isolate different cellular populations in the brain parenchyma and that permits to obtain enough protein amounts of these different cell types to be used in proteomic techniques such us gelatin zymography, western blot or multiple ELISA.2. Neutrophil infiltration in infarcted and hemorrhagic areas, and local levels of MMP-9 are related to type IV collagen degradation in the basal lamina and blood brain barrier disruption. Inflammatory and vascular MMP-9 is directly involved in hemorrhagic transformations that follow ischemic stroke.3. rt-PA treatment promotes neutrophil degranulation ex vivo and the release of MMP-9, but also MMP-8 and TIMP-2.4. MMPs' Gelatinase/Collagenase activity appears in the very early moments after cerebral ischemia, as soon as 30 minutes after artery occlusion in a rat model of focal ischemia. This activity is localized first in the nucleus of cells and after long periods of ischemia the activity spreads to cytoplasm. 5. MMP-13 is activated in human and rat brain parenchyma after cerebral ischemia and is found basically in neurons but also in oligodendrocytes and astrocytes. MMP-13 is localized mostly in the nucleus of these cells in the infarct core. Moreover, oxygen and glucose deprivation (OGD) promotes its nuclear localization in primary neuronal cell cultures.6. MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13 and TIMP-1 are found increased in human brain samples after an ischemic stroke. In the ischemic brain, MMP-9 and TIMP-2 are basically produced in blood vessels and MMP-10 is mainly produced by neurons.Altogether, these results improve the knowledge on the cerebrovascular pathology itself but also on the role of MMPs in the pathophysiology of the disease. We identify new proteases involved in the different types of damage that follow cerebral ischemia and, more importantly, we clarify the cellular and subcellular origin and localization of these MMPs both in the brain parenchyma and in the neurovascular unit