Importancia de los genes fur y thyA en la patogenia de Haemophilus parasuis

Haemophilus parasuis es un miembro de la familia Pasteurellaceae y un importante patógeno del tracto respiratorio porcino, causante de la enfermedad de Glässer. En la actualidad, esta enfermedad es una de las que tiene mayor incidencia en el sector porcino con una elevada repercusión económica. Por este motivo, es necesario estudiar la biología molecular de este patógeno para poder desarrollar vacunas más eficientes que las existentes hasta el presente. Para abordar dicho estudio es imprescindible disponer de algún proceso de transferencia genética eficaz en H. parasuis. No obstante, dado el desconocimiento que se tenía de dicho patógeno, no se conocía ningún mecanismo natural o de laboratorio que permitiera introducir DNA en H. parasuis. Por ello, el primer objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar un método de transferencia genética en H. parasuis que permita estudiar posteriormente los genes implicados en su virulencia y en la colonización del hospedador.En la presente tesis se ha demostrado por vez primera que H. parasuis es capaz de transformar de forma natural si el DNA exógeno contiene la secuencia ACCGAACTC, la cual es muy similar al motivo ACCGCACTT descrito en H. influenzae como Uptake Signal Sequence. Además, se ha optimizado este proceso, determinando las concentraciones más adecuadas de células bacterianas, AMPc y DNA transformante, así como el tiempo de incubación. Un segundo objetivo de este trabajo ha sido averiguar el papel de la timidilato sintasa, enzima clave en la síntesis de desoxitimidina monofosfato (dTMP), en la virulencia de H. parasuis. Para ello, se ha construido un mutante knockout en el gen thyA de H. parasuis y se ha determinado la capacidad de colonización y la inmunogeniciad de la cepa salvaje y de dicho mutante thyA en un modelo animal de cobayas. Los resultados han mostrado que la cepa defectiva en la enzima timidilato sintasa tienen una menor capacidad de colonización, a pesar de que es capaz de inducir una respuesta inmune en el animal. Por ello, el mutante thyA de H. parasuis puede ser un buen candidato para el desarrollo de futuras vacunas.Finalmente, en este trabajo se ha estudiado la importancia de la proteína Fur en la virulencia de H. parasuis. Dicha proteína es un regulador pleiotrópico que, entre otras funciones, controla los mecanismos implicados en la captación de hierro. Para abordar esta parte del trabajo se propuso la construcción de un mutante de H. parasuis defectivo en la proteína Fur. Los resultados obtenidos han mostrado claramente que dicha proteína es esencial para la viabilidad de esta bacteria. Así, se ha determinado el entorno genético del gen fur y se ha confirmado la no viabilidad de los mutantes fur mediante la obtención de cepas merodiploides.Haemophilus parasuis, is a member of the family Pasteurellaceae and an important respiratory-tract pathogen of swine, which is the etiological agent of Glässer's disease. At present, the H. parasuis infections produce significant mortality and morbidity in pig farms, giving rise to important economic losses in this industry. For this reason, it is necessary to study the molecular biology of this pathogen to develop vaccines more efficient. Because no genetic manipulation system is available for H. parasuis so far, the first objective of this work was to develop a method of gene transfer to study the genes involved in virulence of this organism. In this work has been demonstrated for the first time that H. parasuis is capable of transforming exogenous DNA which contains ACCGAACTC sequence. This sequence is very similar to the motive ACCGCACTT described in H. influenzae as Uptake Signal Sequence. In addition, this process has been optimized, determining the most appropriate concentrations of bacterial cells, cAMP and transforming DNA, as well as the incubation time.A second objective of this study was to determine the role of thymidylate synthase enzyme in the virulence of H. parasuis. This enzyme is essential for dTMP synthesis and, consequently, for DNA replication. To do so, a H. parasuis thyA mutant was constructed in order to analyze its colonization characteristics and its capacity to generate serum bactericidal activity in infected guinea pigs. The data showed that colonization by the H. parasuis thyA mutant was much less than that of the wild-type strain. Nevertheless, the mutant generated a strong immunogenic response similar to the wild-type strain. Therefore, the H. parasuis thyA mutant can be a good candidate to develop future vaccines. Finally, this work has studied the importance of the Fur protein in the virulence of H. parasuis. This protein is a global regulator which, among other duties, controls the mechanisms involved in iron uptake. To perform this part of the study was proposed the construction of a H. parasuis fur mutant. The results have clearly shown that this protein is essential for the viability of this bacterium. Thus, it has been determined the genetic surrounding of fur gene and has confirmed the non-viability of fur mutants by obtaining H. parasuis fur-defective merodiploid strains