Hibridació genòmica comparada en oòcits: aplicabilitat al Diagnòstic Genètic Preimplantacional

El Diagnòstic Genètic Preimplantacional (PGD) utilitzant la hibridació in situ fluorescent (FISH) per identificar embrions cromosòmicament anòmals analitzant nou cromosomes ha permès incrementar les taxes d'embaràs en certs grups de pacients. Malgrat això, aquesta estratègia presenta certes limitacions, sent la més important el nombre de cromosomes que poden ser analitzats. En aquest treball hem avaluat la fiabilitat de la hibridació genòmica comparada (CGH) per a analitzar el complement cromosòmic sencer, com una alternativa al PGD utilitzant FISH. La CGH proporciona un anàlisi més complert del cariotip i per tant, permetria la transferència de només embrions cromosòmicament normals, que són els més idonis per produir un embaràs viable. La validació de la CGH s'ha realitzat avaluant la complementarietat entre els resultats obtinguts en els primers corpuscles polars (1CP) i els obtinguts en l'oòcit en metafase II (MII). S'han analitzat un total de 106 oòcits donats per 71 dones. En 81 casos s'ha analitzat tant la MII com el 1CP, mentre que en 25 casos s'ha analitzat tan sols un dels membres de la parella. L'eficiència de la CGH ha estat del 80,1% i la taxa de complementarietat del 87,4%. En alguns casos s'ha detectat una manca de complementarietat entre el 1CP i la corresponent MII, explicable per la existència d'un mosaïcisme gonadal en alguna d'aquestes pacients.La incidència d'aneuploïdies ha estat del 45,3%. S'han trobat un total de 80 aneuploïdies, afectant a gairebé tots els cromosomes tot i que en general, els cromosomes petits, tendeixen a mostrar-ne més.Pràcticament el 50% d'aquestes aneuploïdies corresponen a cromosomes que no són analitzats amb l'estratègia de FISH de nou cromosomes degut a que aquests cromosomes no són els responsables de descendència trisòmica viable o de la majoria d'avortaments espontanis. No obstant, les nostres dades indiquen que els errors per aquests cromosomes si deuen ser freqüents en el moment de la concepció però fallen en implantar causant una davallada en les taxes de implantació. Aproximadament un 37% de les parelles 1CP-MII aneuploides mostren errors de cromosomes no inclosos en el cribatge d'aneuploïdies que es realitza en l'actualitat i per tant haurien estat incorrectament diagnosticades com a normals en un PGD emprant FISH per a l'anàlisi de nou cromosomes.S'ha trobat una major proporció d'anomalies en el grup d'oòcits de dones d'edat avançada (60,7%), comparant amb el grup d'oòcits de dones sota els 35 anys (28%). Aquestes diferencies han estat estadísticament significatives. Per una altra banda, les tècniques de FISH i cenM-FISH s'han utilitzat també en aquest treball per a diferenciar les alteracions de cromosoma de les de cromàtida, ja que això no sempre és possible utilitzant CGH. Aquestes dues tècniques han indicat l'existència de dos mecanismes d'aneuploïdia, la separació precoç de cromàtides germanes (PSSC) (68,1%), i la no-disjunció de cromosomes homòlegs (31,9%). La fiabilitat de la CGH no només per a detectar canvis en el nombre de còpies de qualsevol cromosoma en 1CP i oòcits en metafase II, sinó també per a detectar segregacions desequilibrades de translocacions maternes ha estat demostrada. Això fa que la CGH pugui ser utilitzada en PGD de translocacions, per analitzar tan els cromosomes involucrats com els cromosomes no involucrats en la reorganització. Finalment, la CGH s'ha aplicat per a l'estudi de 1CPs en un PGD d'una dona d'edat materna avançada. Aquest protocol és compatible amb una transferència embrionària a dia +4, sense necessitat de congelar els embrions. En conclusió, els nostres resultant indiquen que l'estratègia ideal en un PGD hauria de comportar l'anàlisi de la totalitat de cromosomes ja que algunes aneuploïdies no incloses en l'anàlisi amb FISH poden ser, en realitat, freqüents en el moment de la concepció.Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) using fluorescent in situ hybridization (FISH) to analyze up to nine chromosomes to identify chromosomally abnormal embryos has resulted in an increase of pregnancy rates in certain groups of patients. However, PGD using FISH has several limitations; the most important one is the number of chromosomes that can be analyzed. In this work we evaluate the reliability of using comparative genomic hybridization (CGH) to analyze the whole set of chromosomes, as an alternative to PGD using FISH. The more extensive analysis of the karyotype provided by CGH may allow replacement of only chromosomally normal embryos, which are those most likely to establish a successful pregnancy. The validation of the CGH was performed by the analysis of both, first polar bodies (1PB) and metaphase II oocytes (MII). A total of 106 oocytes donated by 71 women were analyzed. These oocytes correspond to 81 1PB-MII doublets and 25 cells without its partner. The CGH efficiency was 80.1% and the reciprocity rate between the 1PBs and the MIIs was 87.4%. In some cases we detected a lack of reciprocity between the 1PB and the MII results, which can be explained, in part, by the existence of a gonadal mosaicism in some of these patients.The aneuploidy rate was 45.3%. A total of 80 aneuploid events were found. In general, smaller chromosomes were more prone to aneuploidy although almost all chromosomes showed abnormalities. It is worth emphasizing that almost 50% of these aneuploidies correspond to chromosomes that are not analyzed with the nine-chromosome FISH approach for not being commonly involved in trisomic offspring or spontaneous abortions. Nevertheless, errors affecting these chromosomes may be common at conception but fail to implant, causing a decrease in the implantation rate. To date, 37.5% of the aneuploid doublets had aneuploidies affecting chromosomes not included in the current panels for aneuploidy screening. Consequently, they would have been misdiagnosed as normal in a PGD using FISH for 9 chromosomes. We have found a higher proportion of abnormalities in the group of older women (60.7%) compared to the group of women below 35 years old (28%). These differences are statistically significant. On the other hand, FISH and cenM-FISH analysis enable the distinction between chromosome and chromatid anomalies, which is not always possible using CGH. Using these two techniques, we have detected unequivocally two mechanisms of aneuploidy, revealing that as much as two thirds of the aneuploidy events (68.1%) were due to a premature separation of sister chromatids (PSSC), while only one third (31.9 %) were due to chromosome non-disjunction.Additionally, we have demonstrated the reliability of CGH not only to detect single copy number changes involving whole chromosomes in 1PB and MII oocytes, but also to detect unbalanced segregations of maternal translocations. This indicates that CGH could be used for PGD of maternal translocations, detecting also the presence of chromosome abnormalities involving other chromosomes different from those implicated in the rearrangement. Finally, we have applied the CGH to analyze 1PBs within a PGD of an advanced maternal age woman. This protocol was compatible with embryo replacement on day +4, without embryo freezing. In conclusion, our results strength the arguments for the complete karyotyping as an ideal PGD strategy, since aneuploidies affecting chromosomes that are not included in FISH analysis may be common at conception