Anàlisi del mecanisme catalític i de l'especificitat de substrat d'una ß-glucosidasa de Streptomyces sp.

Les ß-glucosidases són enzims que hidrolitzen enllaços b-glicosídics de disacàrids o oligosacàrids, amb una baixa regioespecificitat de manera que reconeixen específicament l'extrem glucídic no reductor i alhora tenen baixa especificitat per l'extrem reductor o aglicó. El mecanisme catalític és un doble desplaçament amb catàlisi àcid/base i formació d'un intermediari glicosil-enzim; la hidròlisi es produeix amb retenció de la configuració del carboni anomèric. En aquest treball s'ha estudiat la ß-glucosidasa Bgl3 d'Streptomyces sp. (ATCC 11238) clonada anteriorment al grup, s'ha millorat la producció de l'enzim posant-lo sota control del promotor de la T7-RNA polimerasa, i s'ha millorat el procés de purificació amb la fusió a una cua d'histidines al seu extrem N-terminal que permet l'obtenció de proteïna pura mitjançant un sol pas de purificació (columna d'afinitat). La proteïna obtinguda ha permès l'obtenció de l'estructura tridimensional de l'enzim per cristal.lografia de raigs X.S'ha caracteritzat l'activitat catalítica de la Bgl3 amb dues bateries de substrats, una que variava l'extrem no reductor per determinar l'especificitat del subseti -1, i l'altre que variava les característiques de l'aglicó amb l'objectiu d'establir una relació lineal d'energia lliure (anàlisi de Hammett). L'estudi de la dependència de l'activitat respecte a la temperatura i al pH, ha permès dilucidar aspectes del mecanisme catalític com l'energia d'activació i la variació dels pKa dels residus catalítics essencials.Per mutagènesi dirigida s'han obtingut enzims sense algun dels dos residus catalítics essencials, i s'ha comprovat la reducció de l'activitat catalítica. S'ha comprovat el paper de cada un d'aquests residus a la catàlisi per rescat químic de l'activitat dels mutants amb l'addició d'un nucleòfil extern, i posterior identificació per Ressonància Magnètica Nuclear dels productes formats.Finalment s'ha avançat en l'estudi de l'especificitat de substrat respecte l'aglicó mitjançant mutagènesi dirigida i caracterització cinètica dels mutants sobre una posició conservada del centre actiu: la cisteïna 181 de la Bgl3.ßeta-glucosidases are enzymes that can hydrolyze ßeta-glycosidic bonds from disaccharides or oligosacharides, with a low regiospecificity, so than they recognize specifically the glucidic non-reducing extreme and they have low specificity for the reducing extreme or aglycon. The catalytic mechanism is a double displacement with catalysis acid/base and formation of an intermediary glycosil-enzyme; the hydrolysis is produced with retention of the configuration of the anomeric carbon. In this work it has studied the ß-glucosidase Bgl3 from Streptomyces sp. (ATCC 11238) cloned before in the group, it has improve the production of the enzyme expressing it under control of T7-RNA polymerase promotor, and it has improve the purity method fusing at the N-terminus of the gene, a 6 histidines tag, allowing pure protein obtaining with a sole step purification (affinity column). Protein so obtained has allowed the resolution of the 3D structure for ray X crystallography.It have characterized the catalytic activity of Bgl3 with 2 sets of substrates, one that vary his non reducing extreme to determine the specificity of subset -1, and the other set that vary the characteristics of the aglycon moiety to determine a free energy relationship (Hammett analysis). The study of the dependence between activity and temperature or pH, has show aspects of the catalytic mechanism as Energy of activation and the pKa variations of the essential catalytic residues during catalysis.Trough site directed mutagenesis, it has been obtained enzymes without any one of the two essential catalytic residues, and it has been check reduction of the catalytic activity. It has been proved the role of those residues in the catalysis with the chemical rescue of the activity of the mutant forms adding an extern nucleophile, and identifying the products with Nuclear Magnetic Resonance.Finally, it have been progress in the substrate specificity respect aglycon by means of site directed mutagenesis and kinetic characterization of the mutants over a conserved position in the active center: the cysteine 181 of the Bgl3