Fenotips tumorals induïts per mutació puntual al codó 12 o 13 del gen k-ras humà

El gen K-ras, és molt important clínicament ja que es troba mutat en un 40% dels casos de carcinomes colorectals i en un 90% dels casos de carcinomes de pàncreas, que constitueixen la segona i quarta causa de mort per càncer en països desenvolupats i juga un paper important en el desenvolupament dels sarcomes. Degut a la importància clínica del gen K-ras, un model que millori el seu coneixement en l'àmbit molecular, ajudarà a predir el comportament biològic del tumor abans de decidir el tractament més adequat per un pacient concret. Aquests coneixements, poden portar a una millora substancial des del punt de vista terapèutic. Les mutacions activants de l'oncogen K-ras, s'han localitzat al codó 12 o 13 del mateix. Prèviament, s'ha associat la presència de mutacions al codó 13 amb un fenotip tumoral menys agressiu que quan aquestes es localitzen al codó 12. Concretament, la mutació al codó 13 s'associa amb menor capacitat invasiva local i metastàsica. L'objectiu d'aquesta tesi es trobar una explicació molecular al diferent comportament clínic descrit amb anterioritat en tumors humans segons si la mutació activant es troba al codó 12 o al codó 13 del gen K-ras. També es preten trobar una explicació molecular a la transformació produïda pel gen normal sobrexpressat, que prèviament s'havia descrit que en determinats models era tumorogènic. Aquest estudi s'ha realitzat en un model in vitro (fibroblasts NIH3T3 de ratolí), transfectats establement amb el gen K-ras humà amb les distintes mutacions i en un modelo in vivo, injectant subcutàniament els transfectants en ratolins atímics i estudiant els sarcomes generats.Les conclusions d'aquest treball són que en el nostre model d'estudi, la mutació al codó 12 de K-ras confereix un fenotip més transformant que la mutació al codó 13 o que la sobreexpresió del gen normal. La causa principal d'aquestes diferències en transformació és la major activació de la via de supervivència cel·lular PI3K/AKT als transfectants amb mutació al codó 12 que els confereix major resistència a l'apoptosi, tant en el model in vitro com in vivo. Per últim, la posició del codó mutat en K-ras confereix especifitat histològica als tumors generats que de manera coherent amb el seu origen mesenquimàtic (NIH3T3) són sarcomes. Els tumors generats amb mutació al codó 12 del gen K-ras constitueixen un possible model de fibrosarcoma i els generats amb mutació al codó 13 del gen K-ras constitueixen un possible model d'histioctioma fibrós maligne; dos tipus de sarcomes humans.K-ras gene is the most frequently mutated ras gene in human tumors. It's mutated in 40% of cases of colorectal carcinomas and 90% of pancreatic adenocarcinomas. These are the second and fourth causes of cancer death in developed countries. K-ras play also an important role in development of sarcomas. A model that improve knowledge of K-ras in a molecular way will help to decide the right treatment to a specific patient.K-ras became oncogenic by single point mutations at codon 12 or 13. Several lines of evidence suggest that the malignant potencial of tumor cells may be influenced not only by the presence or absence of K-ras mutations, but by its molecular nature. Codon 13 mutations have been associated with less aggressive tumoral phenotype than codon 12 mutations in K-ras gene. Codon 13 mutation is associated with less invasive and metastasic capacity.In this thesis, is tested whether K-ras codon 12 mutation would confer upon the cell a more oncogenic phenotype than a K-ras codon 13 mutation and try to find a molecular explanation for these differences. It is also tested the transformation capacity of the K-ras proto-oncogene and molecular explanation of this effect.To this end, NIH3T3 cells (mouse fibroblasts) are transfected with a plasmid containing human K-ras with point mutations at codon 12 or at codon 13 or containing the K-ras proto-oncogene; selected stable transfectants; and evaluated the possible changes in different functions contributing to transformation. It's tested also in vivo model. We subcutaneously injected transfectants in nude mice and generated tumors were compared morphocally, functionally, and molecularly.The conclusion of this work is that K-ras with point mutations at codon 12 confer a more aggressive transforming phenotype, increasing the thresfold of apoptotic induction. In contrast, mutations at codon 13 or the overexpression of K-ras proto-oncogene reduce this thresfold. Increased activation of cellular survive pathway PI3K/AKT confer to K-ras with point mutations at codon 12 resistance to apoptosis, in vitro and in vivo model.And last; the position of mutated codon in K-ras gene confer histologic specificity to generated tumors.Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 12 constitute a possible animal model of human fibrosarcoma. Tumors derived from transfectants with K-ras point mutations at codon 13 constitute a possible animal model of human malignant fibrous histiocytoma