Paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR. Erk i p38 reguladors de la senyalització per aminoàcids

D'acord amb el comitè de nomenclatura gènica (HGNC) de l'organització del genoma humà (HUGO), es defineix com a proteïna HERC tota aquella proteïna que conté com a mínim i de forma conjunta un domini HECT i un domini RCC1 like (RLD) en la seva seqüència. En l'actualitat s'han identificat 6 membres per aquesta família de proteïnes d'entre les quals la proteïna HERC1 és la primera que es va identificar i el membre fundador de la família. La identificació d'aquesta proteïna va tenir lloc mitjançant la búsqueda de seqüències oncogèniques humanes a partir de cèl·lules de càncer de mama, i tot i que s'ha observat la seva sobrexpressió en diferents càncers, i que s'ha descrit la seva interacció amb difererents proteïnes involucrades amb processos de tràfic de membrana, a dia d'avui no es coneix encara quina es la seva funció fisiològica. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR. Amb l'objectiu de facilitar aquest estudi vàrem idear en primer lloc un sistema per a l'estudi de proteïnes gegants per PAGE/SDS que al mateix temps ens permetés l'anàlisi de proteïnes amb pesos moleculars menors en un sol gel. Aquest sistema el vàrem anomenar LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel), i consisteix en un gel que combina de forma contínua un gel de poliacrilamida de baix percentatge d'acrilamida (4%) i una proporció menor de l'habitual d'acrilamida:bisacrilamida (80:1) (que permet l'entrada de les proteïnes gegants al gel) amb un gel en gradient del 6 al 15% amb una proporció acrilamida/bisacrilamida de 40:1. Hem comprobat que aquest sistema permet separar proteïnes des de 5 KDa fins a proteïnes gegants en únic gel, amb els avantatges que això comporta pel que fa al estalvi de temps i de reactius. A l'any 2006, en col·laboració amb el nostre laboratori, es va descriure que HERC1 interacciona amb la tuberina (TSC2), una proteïna que juntament amb l'hamarina (TSC1) forma el complex de l'esclerosi tuberosa (TSC). Aquest complex actua com a regulador negatiu de la via de senyalització de mTOR, estimulant l'activitat GTPasa de Rheb a través del domini GAP de TSC2. En aquest treball hem comprovat que HERC1 s'associa als dos components de l'esclerosi tuberosa (tuberina i hamartina) estabilitzant aquest complex. A més a més, hem observat com aquesta interacció té lloc en menor grau amb els mutants de TSC2 identificats en pacients d'esclerosi tuberosa R611Q i R905Q, és independent de la inhibició de la via de señalización de mTOR induïda por dejuni o de la seva activació mitjançant aminoàcids o insulina. En canvi, tot i aquestes interaccions, HERC1 no sembla participar en la fosforilació de proteïnes involucrades en la via de mTOR com les p70 S6K, 4EBP1, Akt o S6, ni tampoc en la regulació del procés de l'autofàgia. En canvi, si que afecta a un altre procés mTOR dependent com és la biogénesi de ribosomes. En aquest sentit hem pogut comprovar mitjançant experiments de silenciació del gen d'HERC1 que la disminució dels nivells d'HERC1 provoca disminucions significatives dels nivells d'ADN ribosomal 18S així com de l'actividad del promotor d'aquest gen.La realització d'experiments d'activació amb aminoàcids per a l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR ens va permetre observar que el tractament amb aminoàcids indueix la fosforilació de una proteïna de 80-90 KDa, però no de la isoforma p70 de la S6K1. Aquesta observació ens va portar a l'estudi de l'activació de la p70 S6K1 en resposta a aminoàcids, observant que en respuesta a aquests nutrients es produeix l'activació de les proteïnes quinasa activades por MAPKs (MKs), RSK y MSK. A més a més, hem vist que l'activació d'ambdues quinases té lloc en resposta a la activació de les MAPKs, Erk o p38, a través d'un mecanisme compensatori en el qual quan la Erk es troba inhibida, l'activació de la RSK i MSK té lloc a través de p38 i viceversa.According to the Human Genome Organization (HUGO) Gene Nomenclature Committee (HGNC), HERC proteins are defined as those proteins containing both RLD and HECT domains in their amino acid sequence. Currently, six HERC proteins have been identified. The physiological role of HERC1, the founding member of the family, still remains to be clarified. The main objective for this thesis has been the study of HERC1 role in the mTOR signalling pathway. First, we created a new system to study giant and smaller proteins by means of PAGE/SDS in a unique gel. We called it LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel) and is formed by the combination of a low percentage acrylamide gel (4% and a ratio Acrylamide/Bisacrylamide 80:1) and a gradient gel (6-15%, A/B 80:1). This system permits to analyze simultaneously giant and smaller proteins in a unique gel obtaining good separation ressolutions for all proteins and to save time and reactants. It's been described that HERC1 is able to interact with TSC2 (tuberin), a protein which together with TSC1 (hamartin) constitutes the tuberous sclerosis complex (TSC). This complex acts as a negative regulator of the mTOR signalling pathway through the stimulation of Rheb GTPase activity by TSC2 GAP domain. We have proved that HERC1 interacts with both TSC members (tuberin and hamartin) stabilizing it. Furthermore, we have observed that this interaction is lower with TSC2 mutants identified from tuberous sclerosis patients, R611Q and R905Q and is independent of mTOR signalling pathway inhibition by starving or activation by aminoacids or insulin. Despite these interactions, HERC1 isn't involved in the phosphorylation of some mTOR signalling pathway proteins such as p70 S6K, 4EBP1, Akt, S6, nor in the regulation of Autophagy. However, HERC1 is involved in the mTOR dependent process of ribosome biogenesis. We have proved that the HERC1 gene knock down causes a significant decrease of the 18S ribosomal DNA as well as a reduction of the activity of the promoter of this gene.The performance of activation assays with aminoacids in the study of the HERC1 role in the mTOR signalling pathway permitted us to observe that this cell treatment induce the phosphorylation of a 90 KDa protein and a 110 KDa protein, but not the p70 isoform of S6K1. We have seen that these 90 and 110 KDa bands correspond to the kinases activated by MAPKs (MKs), RSK and MSK. Furthermore, we have proved that the activation of both kinases takes place in response of the activation of the MAPKs, Erk or p38 through a compensatory mechanish in which when Erk is not active, the RSK and MSK activation is induced by p38 and viceversa.