Studio delle caratteristiche funzionali degli anticorpi anti-recettore PDGF presenti nel siero di pazienti affetti da sclerodermia

La Sclerodermia è una malattia sistemica caratterizzata da fibrosi cutanea e degli organi viscerali. I fibroblasti sono le cellule responsabili, anche in presenza di piccole quantità di siero, quindi di fattori di crescita, della produzione di notevoli quantità di proteine della matrice extracellulare, come collagene I e III. L’attivazione di tali cellule è sostenuta da una elevata produzione di radicali liberi in grado di aumentare la loro capacità sia di proliferare che di sintetizzare collageno. La produzione di radicali liberi dell’ossigeno avviene mediante un circuito intracellulare che si automantiene, indipendentemente da stimoli esterni, e che passa attraverso l’attivazione selettiva e sequenziale di Ha-ras, ERK 1-2, NADPH ossidasi, spiegando in tal modo la persistente attivazione di queste cellule in vitro e probabilmente anche in vivo. Il nostro gruppo di lavoro ha recentemente dimostrato nel siero di pazienti sclerodermici la presenza di autoanticorpi (immunoglobuline G purificate) diretti contro il Recettore del Platelet Derived Growth Factor (PDGFR), i quali hanno la capacità di convertire, in vitro, i fibroblasti normali in cellule sclerodermiche, caratterizzate da eccessiva produzione di Specie Reattive dell'Ossigeno (ROS), da danno del DNA e da aumento della trascrizione dei geni del collageno. Tali autoanticorpi non hanno alcun effetto biologico su fibroblasti privi del PDGFR e sono specifici della sclerodermia non essendo presenti nel siero di soggetti normali né in quello di pazienti affetti da fenomeno di Raynaud primario o da altre malattie del connettivo. Scopo del lavoro di questa tesi è stata la valutazione dell’ attività biologica, in vitro, degli autoanticorpi contro il PDGFR in una più ampia coorte di pazienti e di controlli sani, mediante un test funzionale basato sulla capacità delle IgG isolate da sangue periferico di stimolare la produzione di ROS in cellule embrionali murine che esprimono il PDGFRα (Fα), in presenza o assenza di specifici inibitori, e non in cellule knock down per tale recettore (F-/-). Mediante l’utilizzo di funzioni statistiche specifiche per saggi diagnostici abbiamo stabilito i criteri di sensibilità e di specificità da seguire per la corretta esecuzione del test. La nostra attenzione si è poi focalizzata sull’analisi degli eventi molecolari intracellulari chiave in seguito al legame IgG SSc-PDGFR. METODI: Abbiamo analizzato 82 soggetti affetti da sclerodermia e 60 controlli sani. Le IgG totali sono state purificate dal siero mediante cromatografia su colonna con proteina A/G, seguita da cromatografia ad esclusione molecolare. La purezza delle preparazione è stata poi valutata mediante colorazione con blu di Coomassie ed immunoblotting con anticorpi specifici. L’attività biologica delle IgG in termini di produzione di ROS intracellulari è stata determinata mediante saggio funzionale, sulle due linee cellulari Fα ed F-/-, dopo incubazione con 2’-7’-dichlorofluorescein diacetate (DCHF-DA). Il PDGF ricombinante è stato utilizzato come controllo positivo. È stata costruita una curva ROC, in base alla specificità e sensibilità del test, per determinare il valore di cut-off ideale in grado di discriminare i malati dai controlli sani. L’attivazione del recettore da parte del PDGF (ligando naturale) e delle IgG è stata monitorata immunoprecipitando il lisato cellulare con anticorpo specifico anti PDGFRα ed analizzato mediante western blot con anticorpo anti fosfotirosina. Lo studio dell’interazione tra recettore del PDGF e sistema della NADPH ossidasi è stata valutata con immunoprecipitazioni con anticorpi anti PDGFRa, gp91phox, e anti Ha-Ras. Per la localizzazione del complesso a livello di membrana abbiamo pretrattato le cellule con β-ciclodestrina, depletandole dal colesterolo, e valutata la fosforilazione della tirosina e l’attivazione del signalling con western blot. RISULTATI: I livelli di ROS indotti dalle immunoglobuline isolate dai pazienti è statisticamente maggiore rispetto a quelli indotti dalle Ig isolate da controlli normali (p<0.0001). La curva ROC ci ha permesso di stabilire un valore di cut-off ideale pari a 50.2 (corrispondente al 89% di sensibilità e il 91% di specificità). Livelli di ROS statisticamente maggiori sono risultati nella popolazione con variante diffusa della Sclerodermia rispetto a quelli con variante limitata. Le IgG SSC sono in grado di immunoprecipitare oltre al PDGFR anche la sub unità gp91phox del sistema della NADPH ossidasi. Gli anticorpi anti recettore del PDGF stabilizzano il legame recettore-gp91phox formando un complesso attivo a livello di membrana. L’interazione delle tre componenti avviene a livello dei lipids raft della membrana plasmatica. I lipidi lo proteggono dall’azione delle le fosfatasi favorendo una persistente produzione di ROS. CONCLUSIONI: La scoperta, nel siero di pazienti affetti da Sclerosi Sistemica, di anticorpi anti-PDGFR funzionalmente attivi ha fatto compiere enormi progressi nella comprensione dei meccanismi eziopatologici alla base della malattia, che restano tuttavia intenso oggetto di studio. Questi autoanticorpi rivestono un ruolo cruciale nella patogenesi della Sclerodermia e per questa ragione rappresentano un marker specifico ed un potenziale target terapeutico. Ad oggi il test biologico risulta essere il principale strumento attraverso cui poter determinare od escludere la presenza di questi autoanticorpi nel siero.Systemic sclerosis (scleroderma; SSc) is a connective tissue disorder characterized by fibrosis of the skin and visceral organs. The accumulation of components of extracellular matrix, such as collagen I and II, in affected organs results primarily from the activity of stromal fibroblasts. Abnormal oxidative stress is responsible of fibroblasts activation and sustains proliferation and collagen gene expression. Free radicals overproduction is due to an amplification self-perpetuating, loop linking Ha-Ras, ROS via ERK1/2. Our group has recently shown, in the serum of scleroderma patient, the presence of autoantibodies (purified G-immunoglobulins) against Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR), which have the capability to convert normal fibroblasts in scleroderma cells, characterized by overproduction of Reactive Oxygen Species (ROS), DNA damage and increased collagen genes transcription. These autoantibodies have not any biological role in fibroblasts without PDGFR and since they are not found in healthy controls, patients affected by Raynaud’s Phenomenon or others connective tissue diseases, they represent specific markers of Scleroderma. The aim of this project was to evaluate, in vitro, the autoantibodies anti-PDGFR biological activity in a large scleroderma patients and healthy controls cohort, using a functional bioassay. The diagnostic performance of the ROS bioassay and the accuracy of the test was established by the support of the statistic analysis. Finally we characterized the mechanism of agonistic PDGFRα autoantibodies leading to activation of signaling cascade, monitoring ROS production in mouse fibroblasts expressing PDGFRα subunits or in PDGFR negative fibroblasts, exposed to purified total IgGs. METHODS: 82 consecutive scleroderma patients and 62 healthy controls were studied. IgGs were purified from serum using immobilized protein A/G followed by size-exclusion chromatography. Purity of IgG preparations was checked by Coomassie blue staining and immunoblotting with anti-cytokine antibodies. IgG stimulatory activity was evaluated by a bioassay based on intracellular ROS production in Fα cells or in F-/- cells, and measured with 2’-7’-dichlorofluorescein diacetate (DCHF-DA) method. Recombinant PDGF was used as internal control. A ROC curve was designed plotting sensitivity and specificity of the bioassay in order to determine a cut-off value to discriminate between positive and negative samples. The receptor activation by PDGF or SSc IgGs was monitored immunoprecipitating total cellular extract of stimulated fibroblasts with anti PDGFRα antibodies and analysed by Western blotting with phospho-tyrosine antibody. The interaction between PDGFR and NADPH oxidase complex subunits was evaluated by selective immunoprecipitations with anti PDGFRa, anti gp91phox and anti Ha-Ras antibodies. To attest the membrane localization of this complex we pretreated the cells with β-cyclodextrin, that induce the cholesterol depletion of membrane, and assayed the sample for tyrosine phosphorylation and ERK1/2. RESULTS: Levels of ROS induced by IgGs purified from serum of scleroderma patients, were statistically higher compared to control IgGs (p