Analisi funzionale e strutturale della nicotinammide mononucleotide deamidasi, un nuovo enzima del metabolismo della vitamina B3

La nicotinammide mononucleotide (NMN) deamidasi è uno degli enzimi chiave del ciclo dei nucleotidi piridinici (PNC), l’insieme delle trasformazioni biochimiche che consentono alla cellula di generare il coenzima NAD dalla vitamina B3 assunta attraverso fonti esogene (dieta, mezzo di crescita) o ottenuta metabolicamente dalla degradazione intracellulare del dinucleotide stesso. Catalizzando la deamidazione della forma mononucleotidica della vitamina (NMN), l’enzima infatti fornisce il substrato per la successiva reazione di sintesi del NAD. Una proteina dotata di attività NMN deamidasica è stata identificata recentemente, mediante un approccio biochimico, nel batterio Shewanella oneidensis. In questo lavoro di tesi, studi genetici in vivo ne hanno confermato il coinvolgimento nel metabolismo della vitamina B3. Analisi di omologia di sequenza hanno rivelato che l’NMN deamidasi è altamente conservata e presente nella maggior parte delle specie batteriche, mentre è assente negli archea e negli eucarioti. In alcuni batteri il dominio responsabile dell’attività catalitica si trova fuso ad una proteina a funzione ancora sconosciuta. Sia l’enzima costituito dai due domini, sia quello a singolo dominio, mostrano una stretta specificità di substrato e una elevata efficienza catalitica. Ciò suggerisce che l’enzima possa svolgere un importante ruolo nella regolazione dei livelli intracellulari di NMN. L’NMN deamidasi è sia filogeneticamente che strutturalmente distinta da tutte le amidoidrolasi ad oggi caratterizzate. L’ enzima ricombinante è stato utilizzato per mettere a punto un saggio enzimatico molto sensibile che consente la determinazione dei livelli cellulari di entrambe le forme mononucleotidiche della vitamina, l’NMN e l’NaMN.Nicotinamide mononucleotide (NMN) deamidase is one of the key enzymes of the pyridine nucleotide cycle (PNC), a network of biochemical transformations that allow cells to recycle the byproducts of endogenous NAD consumption back to the coenzyme, and to salvage the available pyridine bases, nucleosides and nucleotides as NAD precursors. By catalyzing the deamidation of the mononucleotide form of the vitamin (NMN), the enzyme provides the substrate to the subsequent step towards NAD biosynthesis. Recently, through a biochemical approach, a protein endowed with NMN deamidase activity was identified in the bacterium Shewanella oneidensis. In this work, in vivo genetic studies confirmed the role of the enzyme in the vitamin B3 biosynthesis. Sequence homology analyses revealed that NMN deamidase is a highly conserved enzyme present in most bacterial species; it is absent in Archaea and in Eukaryotes. In some bacterial species, the NMN deamidase functional domain is found fused with a protein of unknown function. Both the single- and the two- domain enzymes show a remarkable high affinity for the substrate, as well as a high catalytic efficiency; this result is consistent with the proposed enzyme’s role in contributing to NMN levels regulation. NMN deamidase is both phylogenetically and structurally distinct from enzymes catalyzing the hydrolysis of amide bonds belonging to known superfamilies. The recombinant enzyme was used to set up an enzymatic assay for the determination of intracellular levels of both the monucleotide forms of the vitamin B3, NMN and NaMN