Atividade antifúngica dos fenilpropenos eugenol e isoeugenol sobre cepas de Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast of predominantly opportunistic nature, capable of infecting man and animals. Cryptococcosis mainly affects the central nervous system (CNS), with severe and fatal evolution. This mycosis is related to high mortality rates, especially in individuals with compromised immune systems, such as HIV-positive, transplanted and leukemic. Treatment involves a limited number of antifungal agents, with recognized toxicity, resistance and high costs. In this context, the search for antifungal substances in natural products has been a promising alternative with great attention of the students on the use of phenylpropene compounds (eugenol and isoeugenol), due to the wide spectrum of pharmacological properties, including antifungal activity. The aim of the present study was to evaluate the in silico antimicrobial potential of these phenylpropenes and to investigate the in vitro antifungal activity, its possible mechanisms of action and the effect of the association with antifungal against C. neoformans. The analysis of the antimicrobial potential of phenylpropenes was performed in silico using the Pass® online software. The minimum inhibitory concentration (MIC), minimum fungicidal concentration (CFM), the effect of eugenol and isoeugenol on the cell wall (sorbitol assay) and membrane ergosterol binding were performed by the microdilution technique. The effect of the association of products tested with standard antifungal by the checkerboard method was also evaluated. In the in silico study, eugenol and isoeugenol demonstrated a greater propensity to be active, expressed as a percentage, in relation to fungal microorganisms. The tests for antifungal activity revealed that the phenylpropenes studied promoted antifungal effect with IC50 of 16 μg/mL for the C. neoformans strains, as well as fungicidal action due to the presence of CFM50 of 32 μg/mL. In the investigation of the mechanism of antifungal action it was evidenced that the MIC values of eugenol and isoeugenol against C. neoformans remained unchanged in the presence of 0.8 M sorbitol, suggesting that these compounds do not act through the inhibition of fungal cell wall synthesis. On the other hand, phenylpropene MIC values varied (16 to 128 μg / mL) in the presence of ergosterol (400 μg/mL) in the plasma membrane assay, showing that both compounds form complexes with ergosterol. The associations eugenol-amphotericin B and isoeugenol-amphotericin B were antagonists for the strains tested (LM 615 and INCQS 40221). Thus, these phenylpropenes may represent a new possibility among the products with antifungal activity, since they showed promising activity by a mechanism involving the ergosterol complexation present in the membrane of C. neoformans.NenhumaCryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada de natureza predominante oportunista, com capacidade de infectar homem e animais. A criptococose afeta principalmente o sistema nervoso central (SNC), com evolução grave e fatal. Essa micose está relacionada a elevadas taxas de mortalidade, especialmente em indivíduos com o sistema imunológico comprometido, como os HIV positivos, transplantados e leucêmicos. O tratamento envolve um número limitado de agentes antifúngicos, com reconhecida toxicidade, resistência e elevados custos. Diante desse contexto, a busca por substâncias antifúngicas em produtos naturais têm sido uma alternativa promissora com grande atenção dos estudiosos quanto à utilização dos compostos fenilpropenos (eugenol e isoeugenol), devido ao amplo espectro de propriedades farmacológicas, incluindo a atividade antifúngica. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar através de análise teórica, in silico, o potencial antimicrobiano desses fenilpropenos e investigar a atividade antifúngica in vitro, seus possíveis mecanismos de ação e o efeito da associação com antifúngico contra C. neoformans. A análise do potencial antimicrobiano dos fenilpropenos foi realizada in silico utilizando o software Pass® online. A concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM), o efeito do eugenol e isoeugenol sobre a parede celular (ensaio de sorbitol) e ligação ao ergosterol da membrana foram realizados pela técnica de microdiluição. Também foi avaliado o efeito da associação dos produtos testados com antifúngico padrão pelo método de checkerboard. No estudo in silico, eugenol e isoeugenol demonstraram uma maior propabilidade de serem ativos, expressa em porcentagem, em relação aos micro-organismos fúngicos. Os testes para a atividade antifúngica revelaram que os fenilpropenos estudados promoveram efeito antifúngico com CIM50 de 16 µg/mL para as cepas de C. neoformans, assim como, ação fungicida por apresentarem CFM50 32 µg/mL. Na investigação do mecanismo de ação antifúngica foi evidenciado que os valores de CIM de eugenol e isoeugenol contra C. neoformans permaneceram inalterados na presença de sorbitol 0.8 M, sugerindo que estes compostos não atuam através da inibição da síntese da parede celular fúngica. Por outro lado, os valores de CIM dos fenilpropenos variaram (16 a 128 µg/mL) na presença de ergosterol (400 µg/mL) no ensaio sobre a membrana plasmática, mostrando que ambos os compostos formam complexos com ergosterol. As associações eugenol-anfotericina B e isoeugenolanfotericina B foram antagonistas para as cepas testadas (LM 615 e INCQS 40221). Assim, esses fenilpropenos podem representar uma nova possibilidade entre os produtos com atividade antifúngica, pois mostraram promissora atividade por um mecanismo envolvendo a complexação com ergosterol presente na membrana de C. neoformans