O óleo essencial de lippia microphylla cham. (verbenaceae) modula a via do Óxido nítrico para exercer efeito tocolítico em rata

Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae), known as “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” and “alecrim-pimenta”, is populary used as antiseptic or to treat respiratory disorders. From its leaves, the essential oil (LM-OE) was extracted, that, according to Silva (2013), presented tocolytic effect on rat, with a probably indirect inhibition of Ca2+ influx through voltage-gated calcium channels (CaV). Thus, the aim of this work was to characterize the tocolytic action mechanism of LM-OE on rat. Isometric contractions were recorded to determine and compare the relative efficacy and potency (n = 5). Considering that the NO pathway can negatively modulate the CaV, we decided to evaluate this participation on rat uterus pre-contracted by oxytocin. For that, it was employed L-NAME, a non-selective inhibitor of NO synthase (NOS). The results show that the tocolytic potency of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was approximately 9.5-fold attenuated in the presence of L-NAME (EC50 = 25.6 ± 3.9 μg/mL). Furthermore, this reduction was reversed in the presence of the L-arginine (EC50 = 6.2 ± 1.7 μg/mL), a NOS substrate, and simultaneous presence of the L-arginine and L-NAME (EC50 = 7.2 ± 1.4 μg/mL), confirming the participation of NO pathway in the tocolytic action of LM-OE. Similarly, the relaxant potency of LM-OE was approximately 3.7-fold reduced in the presence of ODQ (EC50 = 10.1 ± 0.9 μg/mL), a soluble guanylate cyclase (sGC) inhibitor, and 3.3-fold in the presence of Rp-8-Br-PET-cGMPS (EC50 = 8.9 ± 0.9 μg/mL), a protein kinase G (PKG) inhibitor. Thus, LM-OE positively modulates the NO/sGC/PKG pathway to promote its tocolytic effect on rat. Given that this pathway can activate the K+ channels, it was questioned if these channels would be involved on tocolytic effect of LM-OE. To confirm this hypothesis, experiments were made in the presence of CsCl, a non-selective K+ channels blocker, and it was observed that the concentration-response curve of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was rightward shifted with an approximately 4.3-fold reduction on its relaxant potency, confirming the participation of K+ channels on tocolytic effect of essential oil. In order to verify the subtypes involved, it was employed selective blockers of K+ channels. Control concentration-response curve was also shifted to the right and the tocolytic potency of LM-OE was attenuated in the presence of tetraethylammonium (EC50 = 10.5 ± 0.3 μg/mL), apamin (EC50 = 10.0 ± 1.0 μg/mL), 4-aminopyridine (EC50 = 12.4 ± 2.0 μg/mL) and glibenclamide (EC50 = 9.7 ± 0.9 μg/mL), the large (BKCa) and small conductance (SKCa) calcium-activated, voltage-gated (KV) and adenosine triphosphate-sensitive (KATP) potassium channels blockers, respectively. Moreover, LM-OE had its tocolytic potency reduced in the same intensity when these four blockers were simultaneously incubated (EC50 = 16.6 ± 2.6 μg/mL), not observing synergistic effect. Therefore, the tocolytic action mechanism of LM-OE on rat involves the positive modulation of the NO/sGC/PKG/K+ channels pathway, suggesting the blockade of calcium influx through CaV, leading to the relaxation of uterine smooth muscle.Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPqLippia microphylla Cham. (Verbenaceae), conhecida como “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” e “alecrim-pimenta”, é usada popularmente como antisséptico ou para tratar distúrbios respiratórios. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (LM-OE) que, de acordo com Silva (2013), apresentou efeito tocolítico em útero isolado de rata, indicando uma provável inibição indireta do influxo de Ca2+ através dos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV). Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata. As contrações isométricas foram monitoradas para determinar e comparar a eficácia e a potência relativas (n = 5). Tendo em vista que os CaV podem ser modulados negativamente pela via do óxido nítrico (NO), decidiu-se avaliar a participação dessa via em útero de rata pré-contraído com ocitocina. Para tanto, utilizou-se L-NAME, um inibidor não seletivo de sintase do NO (NOS). Os resultados evidenciaram que a potência tocolítica do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi reduzida em aproximadamente 9,5 vezes, na presença de L-NAME (CE50 = 25,6 ± 3,9 μg/mL), sendo essa redução revertida na presença de L-arginina (CE50 = 6,2 ± 1,7 μg/mL), substrato para a NOS, e na presença simultânea de L-arginina e de L-NAME (CE50 = 7,2 ± 1,4 μg/mL), confirmando o envolvimento da via do NO na ação tocolítica do LM-OE. Semelhantemente, a potência relaxante do LM-OE foi reduzida em aproximadamente 3,7 vezes na presença de ODQ (CE50 = 10,1 ± 0,9 μg/mL), inibidor de ciclase de guanilil solúvel (sGC), e 3,3 vezes na presença de Rp-8-Br-PET-cGMPS (CE50 = 8,9 ± 0,9 μg/mL), inibidor de proteína cinase G (PKG). Sendo assim, o LM-OE modula positivamente a via do NO/sCG/PKG para promover seu efeito tocolítico em rata. Uma vez que essa via pode ativar canais de K+, questionou-se se esses canais estariam participando do efeito tocolítico do LM-OE. Para confirmar essa hipótese, foram realizados experimentos na presença de CsCl, bloqueador não seletivo de canais de K+, e observou-se que a curva concentração-resposta do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi desviada para a direita com redução da potência relaxante (CE50 = 11,7 ± 1,5 μg/mL) em aproximadamente 4,3 vezes, confirmando a participação dos canais de K+ no efeito tocolítico do óleo essencial. Para verificar quais seriam esses subtipos de canais utilizou-se bloqueadores seletivos. A curva controle concentração-resposta também foi desviada para a direita e a potência tocolítica reduzida na presença de tetraetilamônio (CE50 = 10,5 ± 0,3 μg/mL), de apamina (CE50 = 10,0 ± 1,0 μg/mL), de 4-aminopiridina (CE50 = 12,4 ± 2,0 μg/mL) e de glibenclamida (CE50 = 9,7 ± 0,9 μg/mL), bloqueadores de canais de potássio: ativados por cálcio de grande (BKCa) e de pequena condutância (SKCa), dependentes de voltagem (KV) e sensíveis ao trifosfato de adenosina (KATP), respectivamente. Ademais, o LM-OE teve sua potência tocolítica reduzida quando esses quatro bloqueadores foram pré-incubados simultaneamente (CE50 = 16,6 ± 2,6 μg/mL), não sendo observado efeito sinérgico. Assim, o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata envolve a modulação positiva da via NO/sGC/PKG/canais de K+, sugerindo o bloqueio do influxo de cálcio via CaV e, consequentemente, o relaxamento do músculo liso uterino