Homeostasis control of abscisic acid hormone signaling in Arabidopsis thaliana : the role of post-transcriptional regulation mechanisms in the expression of its PYR/PYL/RCAR receptors  

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Gustavo Turqueto DuarteTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Fitohormônios participam de vários aspectos do desenvolvimento e do ajuste a condições de estresse. A detecção do hormônio por um receptor desencadeia uma reprogramação da expressão gênica que caracteriza a resposta ao hormônio. Parte dessa resposta, envolve a ativação de reguladores negativos que promovem a atenuação da via de sinalização hormonal, participando assim, da reinicialização do sistema. O hormônio ácido abscísico (ABA) é responsável por controlar aspectos tanto do desenvolvimento quanto de respostas a estresses abióticos. A via de sinalização do ABA é composta por receptores PYR/PYL/RCAR, fosfatases do clado A PP2C, e quinases SnRK2 da subclasse III. O aumento dos níveis de ABA é percebido pelos receptores PYR/PYL/RCAR. O complexo ABA e receptor sequestra as fosfatases PP2C, liberando as quinases SnRK2 da regulação negativa pelas PP2Cs. Em seguida, SnRK2 fosforila proteínas downstream responsáveis por ativar programa de expressão gênica em resposta ao hormônio. No entanto, como ocorre a reinicialização da via de sinalização do ABA é um aspecto pouco elucidado. Esse trabalho propõe desvendar novos aspectos do controle da homeostase da sinalização do ABA. Mostramos que os transcritos dos PYR/PYL/RCARs são reprimidos de maneira contínua e robusta por ABA, sugerindo que um feedback negativo atua proeminentemente na expressão dos receptores. Além disso, o tratamento transiente com ABA, revelou que a recuperação dos níveis iniciais dos transcritos dos receptores é lenta, indicando que o controle da expressão dos receptores representa uma etapa limitante para reinicialização dessa via de sinalização. Abordagens genéticas e farmacológicas sugerem que SnRK2s estão envolvidas na ativação de mecanismos responsáveis pela repressão dos genes dos receptores em resposta ao hormônio. O tratamento com o inibidor transcricional (cordicepina) indicou que ABA promove a desestabilização do RNAm dos receptores PYL1/4/5/6. Análises genéticas e moleculares sugerem que na presença de ABA, miR5628, que é específico de Arabidopsis thaliana, promove a clivagem do transcrito de PYL6. Além disso, na presença do hormônio, os mutantes dcp5-1 e xrn4-5, que são deficientes na atividade de decapeamento e de exoribonuclease, respectivamente, apresentam maior quantidade de transcritos de PYL6 do que no tipo selvagem. Deste modo, sugerimos que após clivagem do RNAm de PYL6, o fragmento RISC-3¿ é degradado por XRN4, ao passo que o fragmento RISC-5¿ é decapeado e depois degradado por XRN4. A atividade de decapeamento também deve participar no processo de degradação do RNAm de PYL4 e PYL5, sugerindo que o decapeamento dos transcritos dos genes parálogos PYL4/5/6 é uma característica ancestral. Em conjunto, nossos dados indicam que o controle da expressão dos receptores do ABA é um aspecto importante na regulação da homeostase da sinalização do ABA. Os mecanismos de regulação pós-transcricional participam na atenuação dessa via de sinalização, através da rápida degradação do RNAm de um grupo de receptores parálogos. Por fim, propomos que o miR5628 é uma novidade evolutiva que se integra ao processo da retro-regulação negativa da via de sinalização do ABA, aumentando a eficiência de degradação do RNAm de PYL6Abstract: Phytohormones participate in various aspects of development and adjustment to stress conditions. Detection of a hormone by a receptor triggers a reprogramming of gene expression that characterizes the response to the hormone. Part of this response involves the activation of negative regulators, which promotes the attenuation of the hormonal signaling pathway, and thus, participating in the resetting of the system. The hormone abscisic acid (ABA) participates in some developmental processes and is crucial in triggering responses to abiotic stress conditions. The ABA core signaling pathway is composed of PYR/PYL/RCAR receptors, clade A PP2C phosphatases, and SnRK2 subclass III kinases. Increased ABA levels are perceived by PYR/PYL/RCAR receptors. The ABA and receptor complex sequester PP2C phosphatases, releasing SnRK2 kinases from the negative regulation by PP2Cs. Then, SnRK2 phosphorylates downstream proteins that are responsible for activating a gene expression program in response to the hormone. However, how the ABA signaling pathway is resetted is poorly elucidated. This work aims to unveil new aspects of the control of ABA signaling homeostasis. We showed that PYR/PYL/RCAR transcripts are continuously and robustly repressed by ABA, suggesting that negative feedback acts prominently on receptor expression. Moreover, transient ABA treatment revealed that recovery of initial receptor transcript levels is slow, indicating that control of receptor expression represents a limiting step in the resetting of the ABA signaling pathway. Genetic and pharmacological approaches suggest that SnRK2s are involved in the activation of mechanisms responsible for repression of receptor genes expression. Treatment with the transcriptional inhibitor (cordycepin) indicated that ABA promotes destabilization of PYL1/4/5/6 mRNA receptors. Genetic and molecular analyzes suggest that in the presence of ABA, miR5628, which is specific of Arabidopsis thaliana, promotes the cleavage of PYL6 transcript. In addition, we have shown that in the presence of the hormone, dcp5-1 and xrn4-5 mutants, which are deficient in decapping and exoribonuclease activity, respectively, show a greater amount of PYL6 transcripts than in wild type. Thus, we suggest that upon cleavage of the PYL6 mRNA, the RISC-3¿ fragment is degraded by XRN4, whereas the RISC-5¿ fragment is decapped, and then, degraded by XRN4. Decapping activity may also participate in the degradation process of PYL4 and PYL5 mRNAs in response to ABA, suggesting that decapping of the transcripts of PYL4/5/6 paralogues is an ancestral feature. Taken together, our data shed light on the importance of the control of ABA receptor expression in regulating ABA signaling homeostasis. Post-transcriptional regulation mechanisms contribute to attenuate ABA signaling by promoting the fast degradation of mRNA from a group of paralogous ABA receptors. Finally, we propose that miR5628 is an evolutionary novelty that was integrated in the negative feedback of the ABA core signaling pathway, increasing the degradation efficiency of PYL6 mRNADoutoradoGenetica Vegetal e MelhoramentoDoutor em Genetica e Biologia Molecular2016/04897-3FAPES