Molecular control of mitochondrial function by miRNA let-7b-5p

Orientadores: Leonardo dos Reis Silveira, Murilo Vieira GeraldoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Através de um banco de dados público (MIRWALK) buscando a associação de microRNAs e alvos moleculares na biogênese mitocondrial. A análise bioinformática mostrou interação entre Let-7b-5p e a região 3'UTR de PGC11alfa. A interação física foi ainda confirmada pelo ensaio de luciferase em células musculares esqueléticas de camundongos primários, usando o mimic ou antimir de Let-7b-5p. De fato, demonstrou-se que a transfecção de células musculares esqueléticas de camundongos primários com Let-7b-5p diminui acentuadamente a expressão proteica de PGC11alfa. Esse efeito foi associado à redução da intensidade de fluorescência de mitotracker red, indicando um menor conteúdo mitocondrial em comparação ao controle. Além disso, 8 semanas de tratamento com exercício oxidativo (EO) ou dieta hiperlipídica (HFD) demonstraram afetar a expressão de Let-7b-5p. Enquanto o EO demonstrou diminuir a expressão de Let-7b-5p no músculo sóleo, HFD teve o efeito oposto, aumentando o Let-7b-5p. A expressão de PPARbeta estava claramente relacionada a esses achados, demonstrando que as mitocôndrias são um regulador da expressão de Let-7b-5p no músculo esquelético. Para descobrir como a mitocôndria controla Let-7b-5p, voltamos à análise de bioinformática e observamos que o PPARbeta é amplamente enriquecido em toda a sequência de DNA de Lin28a, sugerindo que o PPARbeta tem um efeito importante sobre a transcrição de Lin28a. Curiosamente, a imagem do footprint no DNA mostrou pontos diferentes que se sobrepõem ao enriquecimento de PPARbeta, indicando que a cromatina é mais aberta pela maquinaria transcricional. De fato, a exposição de células musculares primárias de camundongos a diferentes compostos que deveriam induzir a transativação de PPARbeta, incluindo GW501516, e AICAR demonstrou aumentar Lin28a. Este efeito foi ainda confirmado nas células C2C12. O PPARbeta também foi manipulado pela superexpressão de co-reguladores nucleares, incluindo NCOR1 e PGC11alfa em células MEF. Enquanto PGC1 1alfa aumentou acentuadamente a expressão de Lin28a, observou-se que NCOR1 tinha o efeito oposto. Achados semelhantes também foram observados em células musculares primárias de camundongos. Além disso, nas células com superexpressão de PGC11alfa, a expressão de Let-7b-5p foi reduzida. Para confirmar esses achados, no knockdown do PPARbeta, a expressão de Lin28a foi regulada negativamente e esse efeito foi muito consistente com o aumento da expressão de Let-7b-5p, aumentando a evidência de que o PPARbeta regula a expressão de Let-7b-5p por um mecanismo dependente de Lin28a. De fato, superexpressamos a PGC1alfa em células musculares esqueléticas de camundongos primários com inibidor químico de PPARbeta, GSK0660, e sob essa condição perdemos a expressão de Lin28a e PDK4, um alvo PPAR bem conhecido no músculo esquelético. Finalmente, também demonstramos em biópsia do músculo vasto lateral humano após 8 semanas de EO, um efeito claramente associado à baixa expressão de Let-7b-5p, demonstrando que Let-7b-5p é regulado por PPARbeta em um mecanismo dependente de Lin28a em célula muscular esqueléticaAbstract: We went through public data base (MIRWALK) seeking for association of selected microRNAs and molecular targets for mitochondrial biogenesis. The bioinformatics analysis showed interaction between Let-7b-5p and 3¿UTR of PGC1alpha. Physical interaction was further confirmed by luciferase assay in primary mice skeletal muscle cells using either mimic or antimir of Let-7b-5p. Indeed, transfection of primary mice skeletal muscle cells with Let-7b-5p was demonstrated to marked decrease the protein expression of PGC1alpha. This effect was associated with low intensity of mitotracker red fluorescent light indicating a lower mitochondrial content as compared to control. In addition, 8 weeks of either oxidative exercise (AE) or high fatty diet (HFD) treatment were demonstrated to affect Let-7b-5p expression. While AE was demonstrated to decrease Let-7b-5p expression in soleus muscle, HFD had the opposite effect increasing Let-7b-5p. PPARbeta expression was clearly related to these findings demonstrating that mitochondria is a regulator of Let-7b-5p expression in skeletal muscle. In order, to figure out how mitochondria controls Let-7b-5p we went back to bioinformatics analysis and observed that PPARbeta is largely enriched throughout Lin28a DNA sequence suggesting that PPARbeta has an important effect over Lin28a transactivation. Interestingly, DNAse footprint showed different points overlapping with PPARbeta enrichment indicating that the cromatin is more opened by transcriptional machinery. In fact, exposure of primary mice skeletal muscle cells to different compounds supposed to induce PPARbetatransactivation including GW501516, and AICAR was demonstrated to increase Lin28a. This effect was further confirmed in C2C12 cells. PPARbeta was also manipulated by overexpression of nuclear co-regulators including NCOR1 and PGC1alpha in MEF cells. While PGC1alphamarkedly increased Lin28a expression, NCOR1 was observed to have the opposite effect. Similar findings were also observed in primary mice skeletal muscle cells. Moreover, in PGC1alpha overexpressing cells the Let-7b-5p expression was reduced. To confirm these findings we knocked-down PPARbeta, Lin28a expression was downregulated and this effect was very consistent with increased Let-7b-5p expression increasing the evidence that PPARbeta regulates Let-7b-5p expression by a Lin28a-dependent mechanism. Indeed, we overexpressed PGC1alpha in primary mice skeletal muscle cells with chemical PPARbeta inhibitor, GSK0660, and under such condition we lost the expression of Lin28a and PDK4, a well known PPAR target in skeletal muscle. Finally, we also demonstrated in biopsy from human vasto lateralis muscle after 8 weeks of AE, an effect that was clearly associated with low Let-7b-5p expression demonstrating that Let-7b-5p is regulated by PPARbeta in a Lin28a-dependent mechanism in skeletal muscle cellDoutoradoFisiologiaDoutor em Biologia Funcional e Molecular151520/2015-1CNP