Anticancer and anti-inflammatory activity of red propolis and its bioactive compounds

Orientadores: João Ernesto de Carvalho, Débora Barbosa Vendramini CostaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O microambiente tumoral oferece múltiplos alvos para a terapia anticâncer e o co-tratamento com medicamentos que modifiquem esse microambiente pode promover uma resposta adjuvante na quimioterapia agindo em alvos específicos. A Própolis Vermelha Brasileira apresenta uma composição química única enriquecida em isoflavonoides e a combinação entre fármacos anticâncer e extratos ou compostos derivados de própolis vermelha pode oferecer uma vantagem significativa e eficaz na sensibilização da monoterapia, superando a resistência induzida por fármacos em pacientes com câncer. Esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos antitumorais do extrato etanólico da própolis vermelha (EEPV) in vitro e in vivo, juntamente com sua atividade anti-inflamatória e avaliação de mecanismos de morte celular. A atividade antiproliferativa in vitro foi avaliada em diferentes linhagens celulares tumorais humanas e o aprofundamento dos mecanismos de ação in vitro foram realizados na linhagem PC-3 (adenocarcinoma prostático humano). A atividade antitumoral in vivo do EEPV foi analisada através do modelo de tumor sólido de Ehrlich em camundongos Balb / C machos, tratados por via oral com EEPV (50, 100 e 200 mg / kg) e em camundongos transgênicos para o adenocarcinoma de próstata (TRAMP) que foram tratados com EEPV (50 mg/Kg) cinco vezes por semana durante 30 dias (8 a 12 semanas de idade). A atividade anti-inflamatória foi avaliada pelo edema de orelha induzido por óleo de cróton e pelo edema de pata induzido por carragenina e por diferentes agentes (composto 48/80, bradicinina, prostaglandina E2) em camundongos Balb / C machos. A ativação de neutrófilos foi avaliada através da atividade de mieloperoxidase no modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton. Para o fracionamento bioguiado, o EEPV passou por diferentes métodos de fracionamento e purificação (partição líquido-líquido, coluna seca, coluna aberta com C18, HPLC preparativo, HPLC analítico e RMN), sendo que as frações obtidas em cada passo foram submetidas ao teste para avaliação da atividade antiproliferativa in vitro. O EEPV promoveu inibição do crescimento e citotoxicidade de maneira dependente da concentração, sem seletividade para um tipo tumoral, o que indica que seus efeitos são direcionados a um processo tumoral comum a diferentes tipos de tumor. A investigação do mecanismo de ação em linhagem de próstata (PC-3) revelou que o EEPV foi capaz de inibir a proliferação celular, induzindo a interrupção do ciclo celular na fase G1 e induzindo morte celular por uma combinação de apoptose e necroptose. O EEPV foi capaz de diminuir o crescimento do tumor solido de Ehrlich nas três doses testadas, e nos animais TRAMP, o EEPV retardou a progressão do adenocarcinoma prostático, reduziu a proliferação de células epiteliais, induziu apoptose e diminuiu a expressão de COX-2. Além disso, nos modelos de inflamação, o EEPV apresentou atividade dose-dependente no edema de pata induzido por carragenina, com a maior dose (200 mg / kg) inibindo a formação de edema desde as primeiras horas até o final do experimento. O pré-tratamento com EEPV (200 mg / kg) inibiu significativamente a formação de edema de pata induzida pelos compostos 48/80, bradicinina e PGE2, evidenciando seus efeitos sobre mediadores vasoativos, e a inibição da ativação de neutrófilos foi confirmada pelo edema de orelha induzido por óleo de cróton em camundongos. Por fim, através da avaliação dos dados físico-químicos e espectrométricos desse estudo foi possível o isolamento e a determinação estrutural de uma molécula inédita, que será descrita pela primeira vez na literatura. Sendo assim, as atividades antitumorais e anti-inflamatórias combinadas sugerem que o EEPV atua em múltiplas características do câncer, afetando diretamente a proliferação de células tumorais e o ambiente tumoral, possivelmente modulando a tumorigênese e a inflamação associada ao tumorAbstract: The tumor microenvironment offers multiple targets for anticancer therapy and the co-treatment with drugs that modify this environment may provide an adjuvant response to chemotherapies with specific targets. Brazilian Red Propolis presents a unique chemical composition enriched in isoflavonoids and the combination between anticancer drugs and extracts or compounds derived from red propolis could offer a significant and effective advantage in the sensitization of monotherapy, overcoming drug-induced resistance in cancer patients. The objective of this study was to evaluate the antitumor effects of the Ethanolic Extract of Red Propolis (EERP) in vitro and in vivo, together with its anti-inflammatory activity and evaluation of mechanisms of cell death. The in vitro antiproliferative activity was evaluated in different human cancer cell lines and the in vitro mechanisms of action were further explored in the PC-3 line (human prostatic adenocarcinoma). In vivo antitumor activity was analyzed by the Ehrlich solid tumor model in male Balb / C mice, orally treated with EERP (50, 100 and 200 mg / kg) and in transgenic adenocarcinoma of the prostate (TRAMP) mice who were treated with EERP (50 mg / kg) five times a week for 30 days (8 to 12 weeks of age). The anti-inflammatory activity was evaluated through carrageenan-induced paw edema and through different agents (compound 48/80, bradykinin, prostaglandin E2) in male Balb / C mice. Neutrophil activation was assessed by myeloperoxidase activity in croton oil-induced ear edema. For Bioassay-guided fractionation, EERP has gone through different fractionation and purification methods (liquid-liquid partition, dry column, C18 open column, preparative HPLC, analytical HPLC and RMN), and the fractions obtained at each step were evaluated in vitro for antiproliferative activity in cancer cell lines. EERP promoted growth inhibition and cytotoxicity in a concentration-dependent way, without selectivity for a tumor type, indicating that its effects are directed to a tumor process common among all tumor cells tested. The investigation of the mechanism of action in prostate cell line (PC-3) revealed that the EERP inhibited cell proliferation, inducing cell cycle arrest in the G1 phase and inducing cell death by a combination of apoptosis and necroptosis. EERP was able to decrease Ehrlich solid tumor growth in the three doses tested, and in TRAMP animals, EERP treatment delayed the prostatic adenocarcinoma progression, reduced epithelial cells proliferation, induced apoptosis, and decreased COX-2 expression. In the inflammation models, EERP showed dose-dependent activity in the carrageenan-induced paw edema, with the highest dose (200 mg/kg) inhibiting the formation of edema within the first hours until the end of the experiment. Pre-treatment with EERP (200 mg/kg) significantly inhibited paw edema formation induced by compound 48/80, bradykinin and PGE2, illustrating their effects on vasoactive mediators. Moreover, the inhibition of neutrophil activation was confirmed using the croton oil-induced ear edema in mice. Finally, through the evaluation of physicochemical and spectrometric data of this study it was possible for the isolation and structural determination of an unpublished molecule, which will be described for the first time in the literature. Thus, the combined antitumoral and anti-inflammatory activities suggest that EERP targets multiple hallmarks of cancer, directly affecting tumor cell proliferation and the tumor environment, modulating tumorigenesis possibly through the reduction of tumor-associated inflammationDoutoradoBiologia CelularDoutora em Biologia Celular e Estrutural2013/24416-1FAPES