Investigation of variants associated with leg ulcers in sickle cell anemia through exome sequencing

Orientador: Mônica Barbosa de MeloTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Embora a anemia falciforme (AF) seja resultante de apenas uma troca de bases na posicao 7 do gene da ¿À-globina, os aspectos clinicos desta doenca sao muito heterogeneos. Varias complicacoes podem ocorrer, dentre elas destaca-se a ulcera de perna (UP), que exerce um impacto muito negativo na qualidade de vida dos pacientes e esta relacionada a gravidade da doenca. No entanto, a patogenese desta complicacao ainda nao foi totalmente elucidada. A fim de identificar novas variantes associadas com a UP na AF realizou-se o sequenciamento de exomas em uma amostra da populacao brasileira de pacientes com AF com e sem UP, sendo os resultados validados em uma outra populacao amostral brasileira. A coorte de descoberta consistiu, inicialmente, em 40 pacientes com AF nao aparentados baseando-se na abordagem de comparacao de fenotipos extremos: 20 pacientes sem UP com idade superior a 40 anos, e 20 com UP cronica, todos estes atendidos no Hemocentro da Unicamp, Campinas, SP, Brasil. O DNA foi extraido de leucocitos de sangue periferico e usado para fazer o sequenciamento de exomas. Apos a analise de bioinformatica (que seguiu o pipeline GATK), duas abordagens foram aplicadas para a selecao das variantes a serem validadas: a analise da literatura e menores p-valores. Ao todo, 12 variantes foram selecionadas, sendo uma delas, falso-positivo. As 11 variantes remanescentes foram genotipadas por meio de sequenciamento direto e genotipagem por sondas TaqMan na coorte de validacao, que consistiu em 293 pacientes com AF (destes, 153 sem UP) atendidos em centros no nordeste brasileiro: Fundacao de Hematologia e Hemoterapia da Bahia (HEMOBA) e de Pernambuco (HEMOPE). Apos a genotipagem na coorte de validacao, o teste exato de Fisher revelou diferenca estatistica em uma variante que promove um codon de parada prematuro (rs12568784 G/T) no gene FLG2. Tal associacao foi observada ao serem comparados os genotipos GT e GG entre casos e controles (p=0,03). A literatura fornece evidencias que fundamentam o envolvimento desta variante na UP na AF, uma vez que ela leva a perda de funcao da proteina filagrina-2, resultando no enfraquecimento da barreira da pele, predispondo o individuo a inflamacao e infeccao, o que dificultaria o fechamento de uma lesao . ulcera. Adicionalmente, sugere-se que as demais variantes e seus genes podem ser fortes candidatos para a UP na AFAbstract: Although sickle cell anemia (SCA) results from homozygosity of a single base change at position 7 of the â-globin gene, the clinical aspects of this disease are very heterogeneous. Many complications can occur, among them leg ulcers (LU), which have a high negative impact on patients¿ quality of life and are related to the severity of the disease. Nevertheless, the pathogenesis of this complication has not yet been elucidated. In order to identify novel variants associated with LU in SCA, we performed exome sequencing in a sample of Brazilian SCA patients with and without LU, followed by validation in another Brazilian population sample. Our discovery cohort consisted, initially, of 40 unrelated SCA patients selected based on extreme phenotypes: 20 patients without LU, over 40 years of age, and 20 with chronic LU, all of them treated at Hematology and Hemotherapy Center, University of Campinas, SP, Brazil. DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and used for exome sequencing. After the bioinformatics analysis (which follows GATK pipeline), two approaches were applied for the selection of variants to be validated: literature analysis and lower p-values. Altogether, 12 variants were selected, one of them was a false positive. The 11 remaining variants were genotyped by direct sequencing and TaqMan probes in the validation cohort, which was comprised of 293 SCA patients (of these, 153 without LU) treated at the following centers from Northeast Brazil: Hematology and Hemotherapy Foundation of Bahia (HEMOBA) and Pernambuco (HEMOPE). After the genotyping of the validation cohort, Fisher¿s exact test revealed a statistically significant difference in a stop codon variant (rs12568784 G/T) in the FLG2 gene. This association was observed by comparing GT and GG genotypes between cases and controls (p=0.03). Literature provides evidence that justify this variant¿s involvement in LU in SCA, since it leads to loss of function of the fillagrin-2 protein, resulting in impairment of the skin barrier, predisposing the individual to inflammation and infection, a wound of difficult healing ¿ ulcers. Additionally, we suggest that the remaining variants and the genes in which they occur could be strong candidates for LU in SCADoutoradoClinica MedicaDoutora em Ciências2015/24029-3 FAPES