Neuroprotective effects of cannabidiol in spinal motoneurons and dorsal root ganglion sensory neurons after sciatic nerve crush in neonatal rats : role of CB 1 and CB 2 receptors

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de OliveiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O esmagamento de nervo isquiático de ratos neonatos simula a axonotmese obstétrica, levando à significativa morte de neurônios motores e sensitivos, o que permite a avaliação de efeitos neuroprotetores de novas moléculas, como as relacionadas ao sistema endocanabinoide, espontaneamente ativado em resposta à injúria. Dessa maneira, é possível que o Canabidiol (CBD), através da ativação do sistema endocanabinoide, leve à melhora da resposta regenerativa. O presente trabalho investigou o potencial neuroprotetor do canabidiol e sua ação através de receptores canabinóides após lesão periférica em ratos neonatos. Para isso, ratos neonatos da linhagem Wistar com dois dias de vida, foram divididos nos seguintes grupos experimentais: esmagamento do nervo isquiático e tratamento com veículo (grupo veículo); esmagamento e tratamento com CBD (grupo CBD); esmagamento e tratamento com AM 251 (inibidor de CB 1) + CBD (grupo CBD + AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (inibidor de CB 2) + CBD (grupo CBD + AM 630), esmagamento e tratamento com AM 251 (grupo AM 251), esmagamento e tratamento com AM 630 (grupo AM 630) e esmagamento e tratamento com AM 251 + AM 630 (grupo AM 251 + AM 630). A sobrevivência de motoneurônios, 5 dias e 8 semanas após a lesão, mostrou que o tratamento com CBD aumenta a sobrevivência neuronal em ~54%, tanto 5 dias quanto 8 semanas após a injúria. Os demais grupos experimentais mostraram maior preservação de motoneurônios que o grupo Veículo porém, quando bloqueados ambos os receptores, a sobrevivência foi igual a obtida pelo tratamento com CBD. A longo prazo, apenas o bloqueio de CB 1 reverteu o efeito positivo do CBD. O bloqueio de receptores canabinoides aumenta a morte de neurônios sensitivos, tanto por apoptose quanto devido à lesão. Embora o tratamento com CBD não tenha efeito neuroprotetor no gânglio sensitivo, ele atenua a morte neuronal causada pelo bloqueio dos receptores canabinoides. O tratamento com CBD também preservou ~35% das sinapses no corno ventral e este efeito foi parcialmente revertido pela inativação de CB 2. Os tratamentos somente com os antagonistas mostraram preservação sináptica igual ao grupo veículo. Corroborando com esses resultados, a reação microglial na fase aguda também foi reduzida em 62% pelo tratamento com CBD, sendo maior nos grupos que receberam tratamento somente com os antagonistas de receptores canabinoides. Adicionalmente, o tratamento com CBD ou com AM 251 + AM 630 reduziu a astrogliose reativa 5 dias após lesão. A expressão de transcritos gênicos para receptores CB 1 foi maior no Veículo. Adicionalmente, tanto a administração de CBD sozinho quanto combinado com os antagonistas de receptores CB 1 e CB 2, resultou no aumento da expressão de CB 2 em relação ao controle, sendo, porém, ainda menor quando comparada ao Veículo. Já no gânglio espinal, o tratamento com CBD + AM 630 aumentou os níveis de CB 1, enquanto que o tratamento com CBD + AM251 diminuiu os níveis desse receptor. Ainda, detectamos que não houve diferença estatística na expressão de neurotrofinas na medula espinal, tanto 5 quanto 15 dias após a lesão, nos grupos que receberam a administração de CBD. Porém, a administração dos antagostistas de receptores canabinoides, sozinhos ou em conjunto, reduziram a expressão de BDNF. Já no gânglio, o tratamento CBD + AM 630 aumentou e o tratamento com CBD + AM 251 reduziu a expressão dos fatores neurotróficos, sendo que, quinze dias após a lesão somente o GDNF ainda manteve os níveis elevados, principalmente no grupo CBD. Por fim, a análise da recuperação motora funcional, mostrou que 8 semanas após a lesão o grupo CBD apresentou melhor recuperação em relação ao grupo CBD + AM251. Como um todo, os resultados mostram que o CBD é neuroprotetor, aumentando a sobrevivência neuronal e reduzindo a reação glial após axotomia. Da mesma maneira, a ação seletiva de receptores canabinoides pode resultar em neuroproteção, mesmo na ausência do CBDAbstract: Sciatic nerve crush in neonatal rats mimics the obstetric axonotmesis, leading to an extensive death or motor and sensory neurons, enabling the evaluation of neuroprotective effects of new molecules, such as the ones related to endocannabinoid system, which is spontaneously activated in response to injury. Thus, it is possible that cannabidiol (CBD), through activation of the endocannabinoid system, leads to increased regenerative response. The present work investigated the neuroprotective effect of CBD and its action through endocannabinoid receptors after peripheral nerve lesion in neonatal rats. For this, 2days-old Wistar rats were divided into the following experimental groups: sciatic nerve crush (SNC) +Vehicle treatment (Vehicle group); SNC + CBD treatment (CBD group); SNC + CBD + AM 251 (Cb1 inhibitor) treatment (CBD + AM 251 group); SNC + CBD + AM 630 (CB2 inhibitor) treatment (CBD + AM 630 group); SNC + AM 251 treatment (AM 251 group); SNC + AM 630 treatment (AM 630 group) and SNC + AM 251 + AM 630 treatment (AM 251 + AM 630 group). Motoneuron survival, 5 days and 8 weeks after injury, showed that CBD enhances in about 54% neuronal survival, both 5 days and 8 weeks after injury. The other experimental groups showed higher motoneuron preservation than the vehicle group, but when both Cb1 and CB2 receptors were blocked, the motoneuron survival was the same then after CBD treatment. In long term, only CB1 blockade reversed the CBD positive effect. The blockade of cannabinoid receptors increases the sensory neuron death as a result of apoptosis or lesion. Although CBD treatment did not protect sensory neurons of death, it attenuates the death caused by cannabinoid receptors blockade. CBD treatment also preserved 35% of synapses in the ventral horn and this effect was partially reversed by CB 2 inactivation. Antagonists-only treatments showed synaptic preservation equivalent to Vehicle group. Corroborating with this, the microglial reaction in the acute phase was also reduced by CBD in 62%, being higher in the experimental groups that were treated only with cannabinoid receptors antagonists. Additionally, CBD or AM 251 + AM 630 treatment decreased the reactive astrogliosis 5 days after lesion. Gene transcripts expression for CB1 was higher in Vehicle group. Both CBD alone or combined with CB1 and CB2 receptors antagonists resulted in higher CB2 expression, when compared to control, being even lower when compared to Vehicle. In the dorsal root ganglia (DRG), CBD + AM 630 treatment increased CB1 levels, while CBD + AM 251 decreased it. Still, we did not detect statistical differences in neurotrophins expression in the spinal cord, both 5 days or 8 weeks after lesion, in the experimental groups that received CBD. However, CB1 and CB2 antagonists administration, alone or together, reduced BDNF expression. In DRG, CBD + AM 630 increased and CBD + AM 251 decreased BDNF expression, and 15 days after lesion, only GDNF had elevated levels, especially on CBD group. Lastly, functional motor recovery revealed that, 8 weeks after lesion, CBD group presented improved recovery when compared to CBD + AM 251 group. In general, the data herein shows that CBD is neuroprotective, enhancing neuronal survival and decreasing the glial reaction induced by axotomy. In the same way, the selective action of cannabinoid receptors can also result in neuroprotection, even in the absence of CBDDoutoradoAnatomiaDoutor em Biologia Celular e Estrutural2012/22751-5FAPES