Influence of ultrasound and supercritical CO2 treatment on cellulases activities

Orientadores: Rosana Goldbeck, Julian MartínezDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: As celulases são importantes enzimas empregadas na produção de bioetanol de segunda geração (2G), atuando na biomassa lignocelulósica e promovendo sua hidrólise. O incremento da atividade catalítica das celulases tem particular interesse para a indústria do bioetanol, de modo que o aumento da eficiência de hidrólise contribui para a redução dos custos associados à via enzimática. A aplicação de ultrassom bem como a utilização de fluidos supercríticos como meio reacional enzimático tem sido métodos empregados para incrementar a atividades enzimáticas através das mudanças conformacionais aportadas. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da aplicação dos processos de ultrassom e tratamento com CO2 supercrítico na atividade enzimática de celulases comerciais Celluclast 1,5L e Cellic CTec2 (Novozymes?). Nesse estudo a influência do tratamento com ultrassom foi avaliada nas celulases comerciais utilizando a técnica de planejamento experimental para determinar os efeitos do tempo de aplicação (10 a 330 s), intensidade da sonda ultrassônica (160 a 350 W) e temperatura do meio (25 a 50ºC). Após o planejamento experimental as condições foram validadas e a estabilidade das atividades enzimáticas foi avaliada. O efeito do CO2 supercrítico (SC-CO2) também foi avaliado para ambas as celulases comerciais por meio de planejamento experimental nas condições de tempo de 60 a 180 min, pressão de 100 a 300 bar e temperatura de 40 a 60ºC. As mesmas condições do planejamento experimental aplicadas para as enzimas comerciais foram empregadas para o estudo da hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar (2% m.v- 1) com atividade enzimática inicial ajustada para 10 FPU.gcelulose-1 para ambas as enzimas frente aos dois tratamentos (ultrassom e SC-CO2). Os resultados de atividades enzimáticas foram analisados utilizando o software Protimiza Experimental Design. Para os tratamentos sob sonicação, as condições mais adequadas de aplicação na enzima Celluclast 1,5L foram: tempo de 170 s, intensidade da sonda de 240 W e temperatura de 30ºC. A hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar foi incrementada com a aplicação de ultrassom para ambas enzimas. Quando aplicadas as condições validadas para a hidrólise com a enzima Celluclast 1,5L (200W, 25ºC, 330s), concentrações 89% superiores ao controle de açúcares redutores foram alcançadas. Já para o tratamento com SC-CO2, a Celluclast na temperatura do meio reacional de 40ºC, pressão de 300 bar e tempo de aplicação de 180 min resultou em aumento de 14,31% para atividade enzimática de celulases totais (FPase). No entanto, quando empregado o coquetel Cellic CTec2, um pequeno incremento (3,60%) na atividade enzimática de CMCase foi observado na condição de 60 min, 300 bar e 40ºC. Em geral, a temperatura de 60ºC teve efeito negativo tanto no tratamento supercrítico nas enzimas livres quanto na hidrólise enzimática. O tratamento com SC-CO2 incrementou a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar em 73,6% e 32,5% na concentração de açúcares redutores para Celluclast 1,5L e Cellic CTec2, respectivamente. O tratamento com ultrassom e CO2 supercrítico, em condições otimizadas, levou ao aumento da atividade catalítica de celulases e do grau de hidrólise de substrato lignocelulósico, demonstrando assim potencial aplicação para o aprimoramento de coquetéis enzimáticosAbstract: Cellulases are important enzymes employed in second-generation bioethanol (2G) production, by acting on lignocellulosic biomass and promoting its hydrolysis. The improvement of cellulases enzymatic activities is interesting to the bioethanol industry, such that increasing the hydrolysis efficiency contributes to the reduction of cost associated with the enzymatic step. The application of ultrasonic energy technology as well as the use of supercritical fluids as an enzymatic reaction medium have received great attention to increase the catalytic activity of enzymes through conformational changes. The aim of this study was to evaluate the effect of ultrasound and supercritical CO2 (SC-CO2) treatment on the cellulase enzymatic activity from commercial cellulases Celluclast 1,5L and Cellic CTec2 (Novozymes?).In this work, the influence of ultrasonic treatment was investigated through an experimental design aiming to identify the optimal application time (10s to 330s), the ultrasonic probe intensity (160W to 350W) and temperature (25º to 50ºC) of the process. After the ultrasound application were determined the enzymatic activities (endoglucanase, total cellulase and ?-glucosidase) and the stability of the enzymes were evaluated after 48h. The supercritical CO2 effect was evaluated to both commercial cellulases through an experimental design (CCD). The range of temperature evaluated was 40ºC to 60ºC, pressure 100 to 300 bar, and time 60 to 180 min. The same conditions applied to the commercial enzymes were used to the sugarcane bagasse (2% w.v-1) hydrolysis at a 10 FPU.gcellulose-1 loading for both treatments (ultrasound and SC-CO2). The results were analyzed using the software Protimiza Experimental Design. For the experiments under ultrasonic application, validated condition for Celluclast enzyme were time of 170s, intensity of 240 W and temperature of 30ºC. The sugarcane bagasse enzymatic hydrolysis was increased under sonication for both enzymes. When the validated conditions were applied on the enzymatic hydrolysis with Celluclast 1,5L (200W, 25ºC, 330s), 89% higher concentrations than the control of reducing sugars were achieved. For the SC-CO2 treatment, Celluclast 1,5L under conditions of 40ºC temperature, 300 bar of pressure and time of 180 min resulted in 14,32% increased total cellulase enzymatic activity (FPase). For the enzymatic cocktail Cellic CTec2 a slight improve (3,60%) was detected to CMCase activity at 40ºC, 300 bar and 60 min. In general, the temperature of 60ºC has a negative effect on both enzymatic activity and release of reducing sugars. The enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse with SC-CO2 treatment was increased 73,63% and 32,49% in reducing sugars concentrations for Celluclast 1,5L and Cellic CTec2, respectively. The treatments with ultrasound and supercritical fluid, under optimal conditions, led to favorable results of increase of Cellulase Catalytic activity and increased the sugarcane bagasse hydrolysis, showing great potential to application on improvement of enzymatic cocktails to be applied on bioethanol productionMestradoEngenharia de AlimentosMestra em Engenharia de AlimentosCAPE