Evaluation of the molecular techniques of DNA microarray and LAMP for the identification of the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii species of isolates grown in culture medium and cerebrospinal fluid of patients with meningitis  

Orientador: Maria Luiza MorettiDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Introdução. A meningite criptocócica é uma infecção causada por leveduras do gênero Cryptococcus que acomete principalmente, pacientes com HIV, imunodeprimidos e transplantados de órgãos. Espécies gattii e neoformans são responsáveis por causarem meningite em humanos. Objetivos. O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho das técnicas moleculares de DNA microarray e Loop Mediated Isothermal amplification (LAMP) na identificação de Cryptococcus no líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite criptpcócica diferenciando as espécies gattii e neoformans. Metodologia. Estudo prospectivo desenvolvido no período de agosto de 2016 a outubro de 2018. Foram estudados amostras de líquido cefalorraquidiano positivas para Cryptococcus, positivos para bactérias e negativos para qualquer microrganismo, onde foram obtidas na enfermaria de moléstias infecciosas e do laboratório de microbiologia do Hospital de Clínicas da Unicamp. Trinta cepas de C. gattii foram cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz para testar nas metodologias estudadas. O DNA extraído diretamente do líquor e de seu isolado em cultura, foi submetido a PCR utilizando a região ITS e o gene CAP59 e posteriormente ao DNA microarray, LAMP e sequenciamento. Resultados. Foram extraídos 133 LCR, sendo 11 positivos para Cryptococcus, 15 positivas para bactérias, 107 negativos e trinta cepas de C.gattii. Foram identificados 8 amostras como C. neoformans e 2 como C. gattii e as cepas foram identificadas como C. gattii. Para a plataforma de ITS do microarray, de 11 amostras de LCR que foram extraídos o DNA, 10 amplificaram por PCR. Cinco amostras de LCR foram identificados, e as outras 5 não foram possíveis obterem resultados. Para os isolados testados nessa plataforma, houveram três amostras com reações inespecíficas e 7 foram identificadas corretamente. Para a plataforma de CAP59, houve amplificação por PCR em todas as amostras de LCR. Não houve identificação em três amostras e oito foram corretamente identificadas. Já para os isolados de LCR foi possível identificar corretamente todas as amostras. Foram realizados testes com diferentes iniciadores na metodologia de LAMP (SetA, SetD, Set1, Set2, Set3_neoformans e Set4_neoformans para identificar C. neoformans e SetB/C e Set1_gattii para identificar C. gattii). Dois conjuntos de iniciadores se mostraram específicos para C. neoformans e C. gattii respectivamente: Se3_neoformans e Set1_gattii. De 11 amostras de LCR testadas por LAMP, 9 foram testadas pelos iniciadores Set3_neoformans e duas pelo Set1_gattii. Pelo conjunto Set3_neoformans 55,5% foram identificadas como C. neoformans e em quatro amostras não houve amplificação e nas duas amostras de C. gattii testadas no conjunto Set1_gattii, não foi possível obter amplificação. Todos os isolados testadas pelo Set3_neoformans amplificaram na metodologia de LAMP. O conjunto Set1_gattii, foi testado apenas um isolado (P285) que foi identificado como C. gattii, pois a outra a amostra não cresceu em cultura. As amostras de LCR negativas e positivas para bactérias foram usadas como controle de nossos testes, e todas resultaram negativas. Conclusão. As metodologias provaram ser testes rápidos e confiáveis na identificação de Cryptococcus, porém é preciso que haja mais testes em relação a detecção direto de amostra clínicaAbstract: Introduction. Cryptococcal meningitis is an infection caused by yeasts of the genus Cryptococcus that mainly affects, patients with HIV, immunosuppressed and organ transplanted. Species gattii and neoformans are responsible for causing meningitis in humans. Objectives. The objective of this work was to evaluate the performance of molecular microarray and Loop Mediated Isothermal amplification (LAMP) techniques in the identification of Cryptococcus in the cerebrospinal fluid of patients with cryptococcal meningitis differentiating the gattii and neoformans species. Methods. A prospective study was carried out from August 2016 to October 2018. Cerebrospinal fluid samples were positive for Cryptococcus, positive for bacteria and negative for any microorganism, where they were obtained in the infectious diseases ward and the microbiology laboratory of the Hospital de Clínicas of Unicamp. Thirty strains of C. gattii were given by the Adolfo Lutz Institute to test the methodologies studied. The DNA extracted directly from the CSF and its culture isolate was submitted to PCR using the ITS region and the CAP59 gene and later to DNA microarray, LAMP and sequencing. Results. 133 CSF were extracted, 11 positive for Cryptococcus, 15 positive for bacteria and 107 negative and 30 C. gattii strains. Eight samples were identified as C. neoformans and 2 as C. gattii and the strains were identified as C. gattii. For the microarray ITS platform, from 11 CSF samples that were extracted DNA, 10 amplified by PCR. Five CSF samples were identified, and the other 5 were not possible to obtain results. For the isolates tested on this platform, there were three samples with non-specific reactions and 7 were identified correctly. For the CAP59 platform, PCR amplification was performed on all CSF samples. There was no identification in three samples and eight were correctly identified. For the isolates of CSF, it was possible to correctly identify all the samples. Tests with different LAMP (SetA, SetD, Set1, Set2, Set3_neoformans and Set4_neoformans methods were used to identify C. neoformans and SetB/C and Set1_gattii to identify C. gattii). Two sets of primers were specific for C. neoformans and C. gattii respectively: Se3_neoformans and Set1_gattii. Of 11 CSF samples tested by LAMP, 9 were tested by Set3_neoformans and two by Set1_gattii. For the Set3_neoformans set 55.5% were identified as C. neoformans and in four samples there was no amplification and in the two C. gattii samples tested in the Set1_gattii set, it was not possible to obtain amplification. All isolates tested by Set3_neoformans amplified the LAMP methodology. The set Set1_gattii, was tested only one isolate (P285) that was identified as C. gattii, because the other the sample did not grow in culture. Negative and bacterial positive CSF samples were used as controls for our tests, and all tested negative. Conclusion. The methodologies have proven to be rapid and reliable tests in the identification of Cryptococcus, but more tests are necessary in relation to direct detection of clinical samplesMestradoClinica MedicaMestra em Ciências2016/12414-2FAPES