Evaluation of modular proteins for gene and drug delivery

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de SouzaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Embora a possibilidade de entregar genes exógenos à células pareça promissora, este processo ainda é limitado pela falta de vetores ideais, que sejam ao mesmo tempo seguros e eficientes. As diversas barreiras físicas, enzimáticas e difusionais oferecidas pelas células dificultam a chegada do gene exógeno ao seu compartimento celular alvo, de tal modo que o desenvolvimento de carreadores poderia permitir o surgimento de protocolos mais eficientes de terapia gênica e vacinação por DNA. Neste contexto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento e avaliação de proteínas modulares multifuncionais para atuarem como vetores de entrega gênica. Uma vez que o tráfego intracelular de vírus muito frequentemente utiliza a rede de microtubulos para chegar ao núcleo, existe a possibilidade de mimetizar tal estratégia usando motores moleculares para o transporte. A cadeia leve de dineína Rp3 foi então modificada pela inclusão de um domínio de ligação ao DNA e um peptídeo TAT, o que permitiu que tal proteína se auto estruturasse em nanopartículas que interagem com o pDNA, formando complexos estáveis e positivamente carregados. Tais complexos eficientemente transfectaram células HeLa através de mecanismos dependentes da rede de microtúbulos, indicando que a proteína foi capaz de mimetizar estratégias virais de internalização de genes exógenos com baixa toxicidade e sem elicitar resposta inflamatória. Esta proteína catiônica foi capaz de mediar a entrega tanto de pDNA como de dsRNA, se concentrando rapidamente na região perinuclear. Ensaios in vivo em modelo de vacina de DNA, no entanto, indicaram que tal proteína ainda enfrenta alguns obstáculos que não puderam ser previstos através das análises in vitro. A entrega direcionada de drogas, por sua vez, partilha muitos dos obstáculos da entrega gênica, desde a chegada à célula alvo até a adequada internalização. Neste trabalho, um grupo de proteínas compostas por GFP e diferentes sequências ricas em argininas foi caracterizado para ser usado em ensaios de entrega de drogas, e foi constatado que pequenas alterações na sequência podem accaretar em diferentes perfis de formação de nanopartículas. A oligomerização, bem como a quantia de argininas, juntas determinam a via de internalização de tais proteínas, podendo variar entre mecanismos inespecíficos ou via receptor (CXCR4). A utilização de proteínas modulares se mostrou uma estratégia promissora que permite o ajuste fino das características proteicas, que podem afetar diretamente as propriedades do vetor resultante, bem como sua eficiência de internalizaçãoAbstract: Although delivering exogenous genes to a cell may seem a prosing approach, this strategy is still limited by the lack of ideal vectors, which are both efficient and safe. The several physical, enzymatical and diffusional barriers offered by the cells highly limit the delivery of the transgene to its target inside the cell, therefore the development of carriers could allow the improvement of gene therapy and DNA vaccination protocols. In this sense, the present work proposes the employment of modular multifunctional proteins to act as gene delivery vectors. Since the viruses recurrently use the microtubules network to reach the nucleus, it would be possible to mimic such strategy by using molecular motors as carriers. For that, dynein¿s light chain Rp3 was modified by the addition of a DNA binding domain and a TAT peptide, resulting in a protein that self assembles in nanoparticles that Interact with pDNA, forming stable and positively charged complexes. Such complexes efficiently transfect HeLa cells through mechanisms highly dependent on the microtubules network, indicating that this protein is capable of mimicking viral strategies to internalize exogenous genes with low toxicity and low pro-inflammatory profile. This cationic protein is capable of promoting the delivery of both pDNA and dsRNA, quickly leading to a perinuclear accumulation. In vivo assays in a DNA vaccine model indicate, however, that this vector still faces some obstacles that could not be anticipated from the in vitro assays. Although seemingly different, targeted delivery of drugs faces many obstacles similar to the ones from gene delivery, from the arrival to the target cell up to adequate internalization. A group of proteins composed by GFP and arginine-rich sequences developed for drug delivery protocols was characterized here. Results indicate that minor modifications to the sequence may affect the formation of nanoparticles. Oligomerization, as well as the amount of arginines in the sequence, may influence the internalization pathway, which can vary from unspecific mechanisms to receptor-dependent internalization through CXCR4. The application of modular proteins was shown to be a promising strategy that allows the fine-tuning of protein¿s features, as well as its internalization efficiencyDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutora em Genética e Biologia Molecular2012/18850-8CAPESFAPES