Structural and functional characterization of membrane proteins involved in the peptidoglycan synthesis

Orientador: Andréa Dessen de Souza e SilvaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A parede celular desempenha uma função essencial na manutenção da sobrevivência bacteriana, prevenindo a lise osmótica e conferindo rigidez e formato à célula. As enzimas envolvidas na biossíntese de seu componente central, o peptideoglicano, são potenciais alvos para novos fármacos. Além disto, a maior parte desta via metabólica é bem caracterizada estrutural e funcionalmente. Uma das exceções consiste na etapa de translocação do substrato precursor lipídeo II. As proteínas que medeiam essa atividade celular são chamadas, genericamente, de flippases. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi a caracterização estrutural e funcional da proteína RodA, uma proteína de membrana, com papel de flippase, e que participa dos processos de translocação do lipídeo II no alongamento celular, sendo parte do complexo multiproteico denominado de elongasome. Adicionalmente, este estudo também abordou o entendimento estrutural das proteínas quiméricas (Flippase-PBPs), que contêm tanto a função enzimática da flippase quanto a função enzimática da Penicillin Binding Protein (PBP). A maior parte deste trabalho de doutoramento foi realizada no Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Campinas- SP, contudo, uma parte do estudo foi realizado no Institut de Biologie Structurale (IBS), em Grenoble, na França. Nossa abordagem experimental consistiu na expressão das proteínas em sistemas de expressão bacterianos e do tipo cell-free, na purificação e seleção dos detergentes apropriados para a solubilização das proteínas de membrana, na caracterização hidrodinâmica por ultra centrifugação analítica (AUC) e espalhamento de luz dinâmico (DLS), na cristalização (in surfo e in cubo) e na caracterização da atividade enzimática da RodA em relação à atividade de flippase e de GTase. Os resultados obtidos mostraram a eficiência do cell-free em expressar as proteínas e, adicionalmente, mostraram que este tipo de sistema acarreta em protocolos de purificação mais simples quando comparados a protocolos desenvolvidos com base em sistemas bacterianos de expressão. A caracterização da Flippase-PBP complexada com detergentes mostrou que ela é monomérica e estimou, numericamente, seu raio hidrodinâmico e seu quociente friccional. A cristalização in cubo foi implementada como técnica principal de cristalização e ensaios iniciais foram realizados com a RodA e com a Flippase-PBP. Os resultados da caracterização funcional da RodA (E. coli e B. subtilis) serão publicados em breve e demonstraram a ação enzimática desta proteína no que tange à translocação do lipídeo II e à ação catalítica de transglicosilaçãoAbstract: The cell wall plays an essential role in the maintenance of bacterial survival, preventing osmotic lysis and providing rigidity and shape to the cell. The enzymes involved in the biosynthesis of its central component, the peptidoglycan, are potential targets for novel pharmaceuticals. In addition, most of this metabolic pathway is well-characterized structurally and functionally. One of the exceptions consists of the translocation step of the precursor substrate named lipid II. The proteins that mediate this cellular role are designated, generically, as flippases. In this sense, the objective of this work was the structural and functional characterization of the RodA protein, a membrane protein that participates in the process of lipid II translocation during the cell elongation, being part of the multi-protein complex called the elongasome. Additionally, this study also addressed the structural understanding of the chimeric proteins (Flippase-PBPs), which contain the enzymatic functions of both flippase and Penicillin Binding Protein (PBP). Most of the doctoral work described here was performed at the Brazilian Biosciences National Laboratory (LNBio), Campinas, Brazil; nevertheless, one part of the study was carried out at the Institut de Biologie Structurale (IBS), Grenoble, France. In terms of the methodologies, our approach consisted in protein expression using bacterial- and cell-free-based systems, purification and selection of detergents suitable for the solubilization of the membrane proteins, hydrodynamic characterization through analytical ultracentrifugation and dynamic light scattering, crystallization (in surfo and in cubo), and characterization of the enzymatic activity concerning the flippase and GTase activities of RodA. The results thus obtained showed the efficiency of the cell-free system in expressing the proteins and, additionally, showed that this type of system leads to simpler purification protocols when compared to protocols developed with bacterial expression systems. The characterization of the Flippase-PBP-detergent complex demonstrated that it is monomeric and numerically estimated the values for its hydrodynamic radius and its frictional quotient. The crystallization in cubo was implemented as the main crystallization technique and initial trials were performed with RodA and Flippase-PBP. The results of the functional characterization of RodA (E. coli and B. subtilis) will be published shortly and demonstrate the enzymatic action of this protein with regard to the translocation of lipid II and the catalytic action of transglycosylationDoutoradoMicrobiologiaDoutor em Genetica e Biologia Molecular2013/22681-0FAPES